不同体色菲牛蛭体成分差异研究

贾荟瑾,杨秀娟,邓 斌,刘艺端,许文坤,王如飞,戚 敏*

(1.云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明 650201;2.云南农业大学云南省动物营养与饲料重点实验室,云南昆明 650201;3.云南省农村科技服务中心,云南昆明 650021;4.云南省畜牧总站,云南昆明 650224)

菲牛蛭是一种水蛭,俗名金边蚂蟥,是一种特色的药用动物资源[1]。菲牛蛭灰分为1.33%、粗脂肪为1.35%、水分为80.55%,粗蛋白含量较高,粗脂肪含量低[2]。菲牛蛭含16种脂肪酸,占脂肪酸总量的97.39%,其中饱和脂肪酸占63.34%,不饱和脂肪酸占34.05%,含量最高的脂肪酸是十六烷酸(棕榈酸)(达23.78%),其次是9-十八碳烯酸(油酸)占12.53%[2]。菲牛蛭体含有Ca、Fe、Mg、Mn、Zn、Cu、V、Cr共8种元素,其常量元素中Ca的含量较高,为14.11 mg/g,微量元素中Fe与Zn的含量较高,分别为1.33和1.37 mg/g,且菲牛蛭体内的Fe、Mg、Zn微量元素符合抗癌药物微量元素范围[3]。菲牛蛭含有多种活性成分,其中菲牛蛭素是蛋白质和天然抗凝血物质,与胰岛素、青蒿素并称为“世界三素”[4],通常用抗凝活性来表示菲牛蛭素的含量,抗凝活性越高,菲牛蛭素含量越高,抗凝效果也越好。现代医学表明,菲牛蛭素可治心脑血管疾病,在动脉粥样硬化、败血性休克、高血压和缺乏抗凝血酶因素方面也具有巨大的优势和广阔的应用前景[5]。裴强等[6]采用菲牛蛭冻干粉成功治疗2例急性白血病合并肺栓塞患者,目前相关研究已经通过云南省第一人民医院医学伦理委员会鉴定。

目前,随着野生菲牛蛭资源的逐渐稀缺,菲牛蛭素变得愈发珍贵,高质量地提取菲牛蛭素势在必行。近年来,国内已有许多关于品种[7]、体重[8]、饲料[9]、冻存时间[10]、部位[11]、菲牛蛭素检测方法[12]等因素是否会对菲牛蛭体成分和抗凝活性造成影响的研究,但针对不同体表颜色是否会影响其体成分及抗凝活性未见相关报道。已知有2种体表颜色的菲牛蛭,其背部分别呈黄褐色和橄榄绿色,均有5条细密的绿黑色斑点组成的纵线,腹面浅黄色、平坦,散布不规则暗绿色斑点。该研究以菲牛蛭的2种体色作为切入点展开相关研究和讨论,为菲牛蛭的进一步开发利用提供更科学完善的基础研究数据。

1 材料

1.1 试验动物活体体重为4.0 g左右的黄褐色和橄榄绿色菲牛蛭(各30条,健康状况良好),由云南海瑞迪生物制药有限公司提供。试验在云南农业大学动物科学技术学院云南省营养与饲料重点实验室进行。

1.2 主要试剂液氮、无水硫酸铜、无水硫酸钠、浓硫酸、6 mol/L盐酸水解溶液、柠檬酸钠缓冲溶液、0.9%氯化钠、0.5%牛纤维蛋白原缓冲液,均由云南农业大学动物科学技术学院云南省营养与饲料重点实验室提供。

1.3 主要仪器冷冻干燥机(型号FD-1C-50),购自北京博医康实验仪器有限公司;全自动凯氏定氮仪(型号SKD-1000),购自上海沛欧有限公司;pH计(型号pHS-3D),购自上海精密科学仪器有限公司;氨基酸全自动分析仪(型号A300),购自德国曼默博尔公司。

2 方法

2.1 试验动物分组将试验所用菲牛蛭按体表颜色平均分为2组,每组3个重复,每个重复10条。

2.2 试验前处理将菲牛蛭称重后,放入液氮处死,然后用不锈钢粉碎机粉碎,于FD-1C-50冷冻干燥机冷冻干燥后称重[13],备用。

2.3 水分的测定水分含量采用冷冻干燥法测定。

式中:X为水分含量(%);Ma为称量皿的重量(g);Mb为样品+称量皿的重量(g);Mc为冻干后样品+称量皿的总重(g)。

2.4 蛋白质的测定使用全量凯氏定氮法。称0.2 g样品(准确至0.000 1 g)于消化管中,加入无水硫酸钠、硫酸铜和浓硫酸消化,用SKD-1000上海沛欧全自动凯氏定氮仪测定,当溶液颜色由蓝色变为浅红色时即为滴定终点,记下此时硫酸标准溶液的体积用量。

式中:V0为滴定空白样时的硫酸用量,mL;V1为滴定样品时的硫酸用量,mL;0.014为1 mL盐酸标准滴定溶液(c=1.000 mol/L)相当的、以克表示的氮的质量标准硫酸的浓度;c为标准硫酸的浓度,mol/L;6.25为氮换算成蛋白质的平均系数;m为样品质量,g。对样品和空白对照作2次平行测定,结果为算术平均值。

2.5 水解氨基酸的测定采用氨基酸全自动分析仪柱后衍生法测定。样品预处理为酸水解:称取100 mg样品于20 mL安瓿瓶中,加10 mL 6 mol/L盐酸水解溶液封管,(110±2)℃恒温干燥箱水解24 h。冷却、混匀、过滤,用移液管取适量滤液于浓缩器中60 ℃抽真空蒸发。加3～5 mL柠檬酸钠缓冲溶液,摇匀,4 000 r/min离心,取上清液上机测定。

定量测定及结果计算公式:

式中:n为样品水解溶液稀释倍数;Ai为样品溶液对应氨基酸峰面积;V为样品水解溶液体积,mL;c为标准工作溶液对应氨基酸浓度,nmol/mL;M为氨基酸摩尔质量,g/mol;Vst为氨基酸标准溶液进样体积,μL;Ast为氨基酸标准溶液对应氨基酸峰面积;m为样品质量,mg;Vi为样品溶液进样体积,μL。

2.6 抗凝活性的测定通过凝血酶滴定法测定。称量(0.10±0.000 1)g菲牛蛭素冻干粉并加入3 mL 0.9%NaCl,混合并浸提30 min,4 000 r/min离心20 min,上清液收集100 μL。加入0.5% 200 μL牛纤维蛋白原缓冲液,混合,并在37 ℃水浴中以5 μL/min滴加凝血酶并轻轻摇动直至形成絮状沉淀或凝固,记录滴定度。1个ATU等于中和1个NIH凝血酶所用菲牛蛭素质量。

抗凝血酶活性(U/g)=

2.7 数据的统计分析采用Spss19.0软件对试验数据进行统计分析,试验数据以“平均值±标准差”表示,采用F检验对菲牛蛭中的水分、粗蛋白质、水解氨基酸及抗凝活性的结果进行差异显著性分析,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

3 结果与分析

3.1 不同体表颜色菲牛蛭水分及粗蛋白质含量分析按照“2.3水分的测定”及“2.4白质的测定”方法测定菲牛蛭水分和粗蛋白质,其含量见图1。图1表明,不同体表颜色菲牛蛭水分及粗蛋白质含量差异不显著(P>0.05)。

注:小写字母相同代表差异不显著(P>0.05)。Note:The same lowercase indicates the difference is insignificant(P>0.05).图1 不同体表颜色菲牛蛭水分及粗蛋白质含量Fig.1 Moisture and crude protein content of Hirudinaria manillensis with different body colors

3.2 不同体表颜色菲牛蛭氨基酸含量分析按“2.5”处理方法对不同体表颜色菲牛蛭的氨基酸含量进行测定,氨基酸标准品图谱、氨基酸样品图谱、氨基酸含量比较见图2、3及表1。

图2 氨基酸标准品图谱Fig.2 Atlas of amino acid standards

图3 氨基酸样品图谱Fig.3 Atlas of amino acid samples

结果表明:黄褐色菲牛蛭的精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、药用氨基酸、呈味氨基酸、药用氨基酸与总氨基酸比值、呈味氨基酸与总氨基酸比值均较橄榄绿色菲牛蛭显著升高(P<0.05);黄褐色菲牛蛭的丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、组氨酸较橄榄绿色菲牛蛭显著降低(P<0.05)。

表1 不同体表颜色菲牛蛭氨基酸含量比较Table 1 Comparison of amino acid content of Hirudinaria manillensis with different body colors 单位:mg/g

3.3 不同体表颜色菲牛蛭抗凝活性分析图4表明,不同体表颜色菲牛蛭抗凝活性差异显著(P<0.05),其中黄褐色菲牛蛭抗凝活性比橄榄绿色菲牛蛭高37.00%。

注:不同小写字母代表差异显著(P<0.05)。Note:Different lowercases indicate significant difference(P<0.05).图4 不同体表颜色菲牛蛭抗凝活性Fig.4 Anticoagulant activity of Hirudinaria manillensis with different body colors

4 结论与讨论

4.1 菲牛蛭中氨基酸影响因素分析天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、精氨酸这9种氨基酸人体自身不能合成,但人体需要它们维持氮平衡,因此被称为药用氨基酸。谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸具有鲜味,通常被称为呈味氨基酸。

苗艳丽等[3]采用内标法对广西科康生物有限公司生产的菲牛蛭干品氨基酸含量进行测定,发现其含有16种氨基酸,包括8种必需氨基酸,但由于产生峰重叠,未检出缬氨酸和蛋氨酸。陈琛等[4]发现,菲牛蛭氨基酸组成比例中必需氨基酸与总氨基酸的比值(EAA/TAA)为36.87%,必需氨基酸与非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)为58.41%,符合FAO/WHO推荐值,具有良好的氨基酸组成比。刘丽芳等[14]采用HPLC-柱后衍生法研究宽体金线蛭氨基酸组成的差异,发现炮制前氨基酸总量为73.94%,含量最高的是亮氨酸,其次是缬氨酸,谷氨酸含量最低。对比发现,两种体表颜色菲牛蛭总氨基酸含量均高于宽体金线蛭。杨秀娟等[8]对不同体重菲牛蛭氨基酸含量进行差异显著性研究,结果发现不同体重菲牛蛭的天冬氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸6种氨基酸和水解氨基酸总量有显著差异(P<0.05),而药用氨基酸含量差异不显著(P>0.05)。该研究关于两种体表颜色菲牛蛭的水解氨基酸研究结果表明,黄褐色菲牛蛭药用氨基酸含量、呈味氨基酸含量均高于橄榄绿色菲牛蛭。以上研究表明,品种、体重、颜色均对水蛭氨基酸含量及比例有一定影响。该研究创新之处在于首次将颜色作为影响菲牛蛭氨基酸含量的因素纳入考虑范围,具有一定的新颖性和独特性,可为菲牛蛭的进一步开发利用提供基础研究数据。

4.2 菲牛蛭中抗凝活性影响因素分析针对使用不同的水蛭素提取工艺和检测方法得到的水蛭素含量不同这一问题,近年来有相关的研究和讨论。张彬等[15]分别采用3种不同的提取方法(即盐浸提法、丙酮浸提法、醇浸提法)和凝血酶滴定法对3种地方的野生菲牛蛭(广东菲牛蛭、广西菲牛蛭和海南菲牛蛭)和2种饲料饲养的菲牛蛭(野生和养殖菲牛蛭)的抗凝活性进行测定,发现不同饲料饲养的菲牛蛭抗凝活性无显著差异(P>0.05),说明人工养殖不会影响菲牛蛭的抗凝活性。何梦雪等[16]用凝血酶滴定法比较不同提取方法对菲牛蛭抗凝活性成分的分离作用,发现盐浸提法比水提法、水提醇沉法、丙酮法更好。因此该试验采用盐浸提法和凝血酶滴定法提取菲牛蛭样品中的菲牛蛭素以及比较不同体表颜色菲牛蛭中抗凝活性的差异有一定的科学依据,但提取和滴定方法不同,得出的结果可能会有差异。两种体表颜色菲牛蛭的水解氨基酸、抗凝活性存在差异。黄褐色菲牛蛭药用氨基酸含量、呈味氨基酸含量和抗凝活性比橄榄绿色菲牛蛭高(P<0.05)。