余氯对小球藻和锦鲤的毒性效应研究

马原野， 丁 谊， 李自荣， 赵珊珊

(1.信阳市南湾水库事务中心， 河南信阳 464000； 2.信阳农林学院水产学院， 河南信阳 464000)

氯制剂作为一类常用的消毒剂被广泛地应用在人们的日常生活和生产中。 当前，生活污水、工业废水及农业面源污染使得自然水体含有较高的余氯，尤其在养殖业，氯制剂的使用更加频繁，如在水产养殖过程中，常使用氯制剂对养殖环境进行消毒，以便消除养殖环境中的病原或病原宿主， 来切断病害的水平传播途径[1]。 此外，由于自然水域含有高浓度的余氯， 在注水或换水过程中往往也使养殖水体赋加了过量的氯。

小球藻是一种单细胞藻类， 在自然界中分布范围广泛。 另外， 小球藻也是重要的生物指示物种之一，对环境污染的反应非常灵敏，因此其被广泛应用于环境毒理学研究中。 已有研究结果表明，不同浓度的余氯会对小球藻的生长状况产生影响， 而且小球藻会对低浓度的余氯表现出一定适应性， 使其生长加快，藻细胞浓度上升[2]，但到达一定浓度以后，余氯毒性累积表现出抑制效应[3]。

余氯对鱼类的呼吸、鳃组织、血红蛋白含量也会产生一定的影响[4]，而且不同浓度的余氯会对鱼苗产生不同程度的毒性效应[5]，余氯可以使鱼类的活动减缓和鳃丝损伤、死亡等危害[6]。

基于以上原因， 为了深入探究不同浓度余氯对鱼类和藻类的影响，本实验以常见的藻类和鱼类，即以小球藻和锦鲤为例， 验证余氯对鱼类和藻类的毒性效应，为水产养殖业余氯控制、减少余氯对养殖动物和养殖环境的影响提供有益的参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

f/2培养基：微量元素、维生素、硅酸钠（10 mg/L）、硝酸钠与磷酸二氢钠复合物、蒸馏水；筛选来自信阳农林学院水产繁育基地的锦鲤约150尾 （10 g/尾）、500 mL锥形瓶、小球藻藻种、牛皮纸、皮筋、光照培养箱、显微镜、10 mL量筒、余氯检测仪、玻璃棒、广口瓶、移液器、浮游植物计数板、计数器、塑料箱、充气泵、盖玻片、载玻片、解剖刀、标签纸。 试验用于配制余氯溶液的次氯酸钠（活性氯含量≥7.5%）购自郑州派尼化学试剂厂。

1.2 试验方法

1.2.1 余氯母液的配制方法

取2 mL次氯酸钠溶液加入量筒中， 再加入8 mL的蒸馏水中稀释5倍。 随后取10 mL稀释后的溶液倒入盛有7 L经过充分曝气的自来水中，用玻璃棒搅拌均匀，取10 mL经充分曝气的自来水加入比色瓶中调零，调零后加余氯检测试剂(HR)，摇匀至无粉末状颗粒后擦干，放入余氯检测仪中，计时1分钟后读数，读出余氯浓度为8.79 mg/L。 以此余氯母液浓度按一定比例稀释至实验所需浓度即可。

1.2.2 小球藻的毒性试验方法

余氯浓度的设置：根据黄洪辉等研究，当余氯浓度低于0.02 mg /L时， 对海洋生物的毒性作用非常小[7]。 因此，当余氯浓度低于0.02 mg /L时毒性试验不予考虑。 预实验结果表明：藻类在0.1-1.5 mg/L的余氯浓度下，小球藻的生长情况差别不明显。 因此，本实验中余氯浓度分别设置为A：0 mg/L、A1：0.5 mg/L、A2：1.0 mg/L、A3：1.5 mg/L、A4：2.0 mg/L、A5：2.5 mg/L、A6：5.0 mg/L、A7：7.5 mg/L。

在余氯对小球藻的毒性实验中， 首先按照f/2培养基配方，配制f/2培养基，随后在每一实验组的锥形瓶中倒入350 mLf/2培养基溶液， 然后分别在每组锥形瓶中接入1 mL的小球藻藻种，混合均匀后，再加入不同浓度的余氯溶液， 经计算每个对照组与实验组锥形瓶中需要加入余氯溶液的体积分别为：0 uL、28.5 uL、56.8 uL、85.3 uL、113.8 uL、142.3 uL、284.3 uL、426.5 uL，随后将各锥形瓶中的溶液摇晃混匀，用牛皮纸包扎好， 打乱顺序， 随机将锥形瓶放入光照培养箱中，光照周期为12L∶12D。每天手动摇晃锥形瓶3次。分别在培养至24 h、96 h时，将不同组锥形瓶中的藻细胞培养液充分摇匀， 取对照组和实验组锥形瓶中的液体1 mL放入离心管中， 摇匀后用移液器吸取100 uL液体到浮游植物计数板中， 在光学显微镜下进行计数。

1.2.3 锦鲤的毒性试验方法

余氯浓度的设置：根据林可椒等研究，当余氯浓度低于0.02 mg /L时， 对鱼类产生的毒性作用较小[8]。在此，当余氯浓度低于0.02 mg /L 时毒性试验不予考虑。 预实验的结果表明：余氯浓度在0.1-1.5 mg/L时， 对锦鲤产生毒性作用较小，12 h、24 h、48 h时间段内锦鲤正常游动， 没有死亡现象。 基于以上因素，余氯浓度设置分别为：0（对照组）B：0 mg/L、B1：0.5 mg/L、B2：1.0 mg/L、B3：1.5 mg/L、B4：2.0 mg/L、B5：2.5 mg/L、B6：5.0 mg/L、B7：7.5 mg/L。

在余氯对锦鲤的毒性实验中， 对照组和实验组各设置3组平行实验，实验首先将对照组和实验组的每个塑料箱加7 L经过曝气2天的自来水， 然后经过计算，在对照组与实验组中分别加入的余氯体积为：0 uL、570 uL、1135 uL、1705 uL、2275 uL、2845 uL、5685 uL、8530 uL，用玻璃棒搅拌均匀，随后在对照组和实验组每个塑料箱中分别放入4条锦鲤（来自信阳农林学院水产繁育基地， 规格约10 g/尾）， 分别在24h、48h时观察锦鲤活动状况、存活情况，并在48h后分别取每个塑料箱中仍存活的锦鲤1条，并剪取适量鳃丝，在显微镜下观察锦鲤鳃丝损伤情况。

2 结果与讨论

2.1 小球藻的生长情况

在24 h和96 h观察不同余氯浓度下锥形瓶中小球藻的生长情况（图1A、B）。 结果表明，小球藻对余氯具有一定的敏感性，在24 h时，实验组和对照组的小球藻生长状况逐渐呈现出差异性， 当余氯浓度≤0.5 mg/L时，小球藻生长状况良好，培养液颜色为浅绿色，当余氯浓度为1.0 mg/L时，培养液颜色变浅，为淡绿色，余氯浓度＞1.0 mg/L时，小球藻生长开始受到明显抑制， 培养液无色； 在96 h时， 当余氯浓度≤1.0 mg/L时， 实验组与对照组小球藻生长状况相似， 培养液颜色均为深绿色， 当余氯浓度＞1.0 mg/L时，小球藻生长受到明显抑制，培养液无色。

图1 各实验组24 h（A）和96 h（B）小球藻生长情况

实验结果表明，从24 h至96 h，小球藻对低浓度余氯呈现出一定适应性，且小球藻生长速度加快，藻细胞浓度上升，培养液颜色由浅绿色变为深绿色，但小球藻在高浓度的余氯下生长受到明显抑制， 培养液颜色不发生变化，仍为无色。

2.2 小球藻对余氯的敏感性

在本实验中，在24 h、96 h，对各组单位体积小球藻培养液中小球藻数量进行了显微计数，结果如表1所示。

表1 24 h和96 h时各组小球藻的数量（1＊10^6）

实验结果表明，同一时间内，小球藻在不同浓度余氯下， 其生长状况存在明显差异。 余氯浓度为0.5 mg/L时，与对照组相比，余氯对小球藻的生长出现了促进作用，但当余氯浓度＞0.5 mg/L，余氯对小球藻的生长产生了抑制， 且余氯浓度达到2.0 mg/L时，小球藻的生长速率比对照组下降50%以上， 出现了明显的抑制效应。 此外，培养时间从24 h到96 h时，随着时间的延长，小球藻在相同浓度的余氯下，生长状况也出现明显差异。 当余氯浓度≤1.5 mg/L时，随着时间增长，小球藻数量急剧增加，而当余氯浓度＞1.5 mg/L，随着时间增长，小球藻数量出现了明显下降。

实验结果表明，小球藻对余氯的敏感性较高，余氯浓度的提高和攻毒时间的延长都会加剧对其生长的抑制。

2.3 余氯对锦鲤的毒性效应

在本实验中，在24 h和48 h分别对不同余氯浓度下的锦鲤活动情况进行了观察。 在24 h时，观察锦鲤的活动情况，发现不同浓度的余氯对锦鲤活动、存活产生一定的影响，当余氯浓度≤1.5 mg/L，锦鲤的活动正常，当余氯浓度＞1.5 mg/L，锦鲤活动异常，时而性情急躁，时而游动缓慢，多在水上层游动，且在余氯浓度为7.5 mg/L时，锦鲤出现了死亡现象。 在48 h时，观察锦鲤的活动情况发现，当余氯浓度≤1.5 mg/L，锦鲤亦正常活动， 但当余氯浓度为5.0 mg/L和7.5 mg/L时，锦鲤的活动异常缓慢，身体侧游，并且死亡率逐渐上升。

余氯可以使鱼鳃组织增生，并且积满黏液，在锦鲤受余氯污染的影响方面， 锦鲤的主要表现为活动减缓、性情暴躁、鳃丝受损、鱼体表面黏液增多、缺氧、死亡等毒性反应[9]。 本实验中，在48 h分别取对照组和实验组中锦鲤一条， 取鳃丝并在显微镜下进行观察（图2）。从图中可以看出，余氯浓度为1.5 mg/L时对锦鲤鳃丝产生的影响不明显，鳃丝颜色正常，没有溃烂。 余氯浓度＞1.5 mg/L时，余氯对锦鲤的鳃丝产生了损伤，锦鲤的鳃丝出现发白，颜色变淡，甚至出现烂鳃现象。 因此，在对水体进行消毒时，应当采取适当措施控制余氯含量，防止余氯超标，进而对水生生物产生不良影响。

图2 各实验组48 h锦鲤鳃丝状况显微观察

2.4 余氯对锦鲤死亡率的影响

实验结果表明， 培养时间在24 h， 余氯浓度为7.5 mg/L时，锦鲤的死亡率达到50%，而对照组和其他实验组的锦鲤均未出现死亡现象。 培养时间在48 h时， 当余氯浓度为5 mg/L， 锦鲤的死亡率达到50%，而当余氯浓度上升至7.5 mg/L时，锦鲤的死亡率达到100%。 实验结果表明，高浓度余氯对锦鲤的毒性效应非常明显， 余氯浓度和培养时间的增加都会导致其死亡率增加。

3 小结

本实验以小球藻和锦鲤为例， 我们初步了解到余氯对藻类和鱼类产生的影响， 并发现余氯对藻类和鱼类的毒性效应存在浓度和时间依赖性， 亦即过高的余氯浓度会对藻类和鱼类在短时间内产生损伤或引起死亡， 而藻类和鱼类长时间暴露在较低浓度的余氯环境中时也会对其造成损伤，甚至引起死亡。