萝卜种质资源根肿病抗性鉴定与抗性基因遗传分析

冉剑钊，孔垂豹，雍晓平，杨 峰，陈 琳，冉 科，冉茂林，李晓梅

（1.四川省农业科学院水稻高粱研究所 四川德阳 618000；2.四川农业大学园艺学院 成都 611130；3.蔬菜种质与品种改良四川省重点实验室 成都 610300）

根肿病又称根癌病，是由芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicaeWoron）侵染引起的一种土传病害，是造成十字花科作物经济损失最严重的病害之一，威胁和制约着十字花科蔬菜产业的发展[1]。20世纪50 年代，十字花科根肿病在我国逐渐流行，至今已蔓延至我国大部分地区，尤其以西南、东南及华中地区危害最重[2]。据统计，根肿病在我国常年危害面积320～400 万hm2，产量损失20%～30%[3]。

萝卜（Raphanus sativusL.）是我国重要的十字花科蔬菜作物之一，年平均种植面积约130 万hm2，年产量约4.5 万t[4]。四川省萝卜种植面积约10 万hm2，为四川省第三大蔬菜，其不仅作鲜菜用，也是四川泡菜加工的重要原料之一，在四川现代农业“10+3”产业体系的“川菜”产业发展中占有举足轻重的地位。萝卜为根肿菌的主要寄主之一，目前辽宁、吉林、黑龙江、河南、重庆、湖北、四川一带均有萝卜根肿病发生，部分严重地块甚至出现绝收现象[5-10]。根肿菌休眠孢子在土壤中存活在20 年以上，一旦污染土壤，采用一般的农业防治方法效果较差，而化学方法对环境污染严重，因此选育抗病品种被认为是最经济、安全且有效的防治方法[11]。

种质资源根肿病抗性鉴定与抗性基因遗传分析是培育抗病品种的理论基础。诸多研究表明，萝卜抗性资源主要集中在欧洲、日本，而中国萝卜普遍缺乏抗性基因[12-15]。Rowe[12]对68 份萝卜资源进行抗性评价，证实日本及部分法国萝卜品种具有较强的根肿病抗性；Yang 等[14]对349 份萝卜资源进行抗性鉴定，发现85.06%的中国萝卜表现感病，而大部分国外材料表现抗病；Wang 等[15]最新研究表明，82.50%中国萝卜和57.56%的韩国萝卜资源表现出感病。有关萝卜根肿病抗性遗传规律与抗性基因的研究较少，大部分学者认为萝卜根肿病抗性由一对显性主效基因控制[15-19]，目前已定位到2 个主效基因位点Crs1[16]、RsCr6[19]，而仅有Gan 等[20]认为萝卜根肿病抗性由隐性多基因控制，并定位到5 个抗性QTLs。

综上，虽然有关萝卜根肿病抗性研究已取得一定进展，然而相对于其他白菜、甘蓝、油菜等十字花科作物来说还远远滞后[21]。同时，根肿菌存在广泛的生理小种分化现象，单一的抗原容易产生抗性丧失的风险[22-24]。因此，开展更广泛的萝卜种质资源根肿病抗性鉴定，培育对多个生理小种具有抗性的品种具有重要意义。笔者利用田间病圃鉴定筛选抗根肿病萝卜种质资源，然后通过室内接种法对遗传分离群体进行抗性精准鉴定，分析抗性基因遗传规律，为后续品种选育应用、抗性基因定位及抗性机制深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 本试验室内接种的根肿菌均采自四川省眉山市萝卜根肿病发病田，经根肿菌Williams 鉴定系统[9]鉴定为4 号生理小种，经SCD 鉴定系统鉴定为Pb3 生理小种（菌样：SCMS-164）[24]。

1.1.2 供试萝卜材料 参与抗根肿病萝卜种质资源田间筛选鉴定的各类萝卜品种/自交系共计54份，均由四川省农业科学院水稻高粱研究所萝卜课题组提供，各材料详情见表1。

表1 供试萝卜材料详情Table 1 Details of radish materials for the experiment

1.2 方法

1.2.1 萝卜种质资源根肿病抗性田间鉴定 萝卜根肿病抗性种质资源田间筛选鉴定在四川省农业科学院水稻高粱研究所萝卜课题组建立的根肿病抗性鉴定圃内开展，病圃位于眉山市东坡区农光村，采用水稻与萝卜轮作模式。水稻采收后，于2019 年9 月，稻田免耕播种萝卜。试验采取随机区组设计，3 次重复，每处理种子播种量不少于100粒，播种出苗20 d 后，施用少量尿素，保持田间土壤湿度在80%～90%，60 d 后进行萝卜根肿病抗性调查。

1.2.2 室内接种鉴定 菌液制备：采集眉山田间发病的萝卜，选择处于发病中期、无皲裂、无腐烂的病根，清洗干净表面泥土，用10%次氯酸钠灭菌5 min，冲洗干净，晾干后，放于-20℃冰箱保存备用。室内接种鉴定时，取适量冻存病根，于培养箱25 ℃活化3 d，再用组织研磨机打碎，8 层纱布过滤，用血球计数板于显微镜下观察滤液休眠孢子浓度，将菌液浓度调至1×108个·mL-1备用。

试验处理与培养条件：选择饱满一致的萝卜种子，75%酒精灭菌90 s，无菌水冲洗3 次，置于发芽盘催芽，基质于播种前1 天浇透水，每处理播种1盘，3 次重复，播种深度2 cm 左右，每穴播种2 颗，每穴注射5 mL 菌液后覆盖基质，穴盘放入塑料托盘内，置于光照培养室，于25 ℃、12 h 光照条件下培养，接种后3 d 内不浇水，中途施用大量溶液水溶肥2 次，55 d 后调查发病情况。

1.2.3 病情分级及抗性评价标准 病情分级参照甘彩霞等[8]分级标准，略有修改（图1）。

图1 根肿病田间（上）与室内（下）抗性分级标准Fig.1 Classification standard of resistance to clubroot in field（up）and indoor（down）

0 级，萝卜根系生长正常，无肿瘤；1 级，根系的须根或侧根有较少细小肿瘤，主根未发生病害；2级，根系的须根或侧根有较多肿瘤，主根发病较轻，稍微肿大；3 级，根系的主根发病较重，异常肿大，大部分须根、侧根有很多肿瘤；4 级，根系的主根异常肿大，须根、侧根有很多肿瘤，根瘤总直径超出颈粗5 倍以上，或根部出现腐烂，甚至植株死亡。

病情指数（DI）＝∑（发病级代表值×各级病株数）/（调查总株数×最高发病级代表值）×100；（1）

DI=0，免疫（IR）；0＜DI≤10，抗病（R）；10＜DI≤30，耐病（T）；30＜DI≤60，感病（S）；DI＞60，高感（HS）。

发病率/%＝发病株数/观察总株数×100。（2）

1.2.4 抗性基因遗传分析 于2020 年4 月，利用免疫级抗性材料（白雪公主）与高感材料（重庆砂罐萝卜）正反交获得F1，2021 年4 月，将F1代材料自交获得F2。2021 年7 月对亲本、F1、F2代材料开展室内接种鉴定，55 d 后调查数据，然后利用Excel 对病情调查结果进行χ2检验分析。

2 结果与分析

2.1 萝卜种质资源根肿病抗性田间鉴定

通过田间病圃鉴定发现，不同萝卜种质资源对根肿病抗性存在差异（表2）。54 份萝卜种质资源发病率在0～100%，病情指数在0～93.73，其中共鉴定到免疫级抗性材料（IR）2 份、抗病材料（R）5 份，耐病材料（T）8 份，感病材料（S）13 份，高感材料（HS）26 份。

表2 萝卜种质资源根肿病抗性田间鉴定结果Table 2 Identification result of resistance to clubroot of radish germplasm

从萝卜种质资源来源分析，发现根肿病抗性材料主要来自国外，占总抗性材料的85.71%，其中2份免疫材料分别来自日本与韩国，4 份抗性材料来自欧洲，仅有1 份抗性材料（捷夏美45）来自国内，而86.05%的国内萝卜表现感病。

从萝卜类型分析，发现抗病、耐病材料以长白萝卜（6 份）、黑萝卜（2 份）、樱桃萝卜（3 份）为主，仅有1 份圆白萝卜郫县小黄叶与1 份红萝卜郫县红萝卜表现出一定耐病性，在青萝卜和紫萝卜中缺乏抗性种质资源。

免疫材料白雪公主与高感材料重庆砂罐萝卜均为高代自交系（图2），用于后续遗传群体构建。

图2 白雪公主（A）与重庆砂罐萝卜（B）根肿病田间抗性鉴定Fig.2 Resistance identification of Snow White（A）and Chongqing Shaguan radish（B）to clubroot in field

2.2 萝卜根肿病抗性基因的遗传分析

为保证遗传分析的准确性，采用更稳定的室内接种鉴定法对遗传群体进行抗性鉴定。由图3、表3 可知，接种55 d 后的抗病亲本（R）未出现任何病征，而感病亲本（S）发病率为100%，且发病等级均在3～4 级，抗性材料白雪公主与高感材料重庆砂罐萝卜正反交F1均表现出免疫级抗性，说明抗性基因具有完全显性质量性状的特征。在500 株F2（R×S）群体中，385 株表现为抗病，115 株表现为感病；在1506 株F2（S×R）群体中，1116 株表现为抗病，390株表现为感病。正反交组合均符合单基因显性遗传3∶1 分离比（抗、感比例在p=0.05 水平时χ2≤3.84），说明白雪公主含有1 对根肿病抗性基因。

图3 亲本及F1 群体根肿病抗性表现Fig.3 Resistance of parents and F1 population to clubroot disease

表3 遗传群体根肿病抗性表现Table 3 Resistance of genetic population to clubroot disease

3 讨论与结论

中国为萝卜起源中心之一，萝卜种质资源丰富多样，拥有近2000 个地方品种，萝卜不仅可以熟食、生食、加工，还可药用和饲用，萝卜产业在我国国民生产生活中具有重要的地位[25]。近年来，随着人口和物质的全球化流动、农业机械化程度的不断提高以及农业机械跨区域作业的实施，根肿病的蔓延速度加大，严重威胁十字花科蔬菜产业的安全生产[26]。萝卜被认为是十字花科作物中具有较强根肿病抗性的作物，但大部分研究结果表明萝卜抗性资源主要集中在国外，而中国萝卜抗源较少[13-15]，笔者的供试材料中86.05%的中国萝卜感病，与前人研究结果相似。感病品种大多数是一些有名的地方品种，如心里美、山东潍县青、重庆胭脂红、成都春不老、重庆草兜等，这些地方资源符合当地消费习惯，在当地萝卜生产与加工产业中发挥着重要作用。然而，根肿病的日益危害与中国萝卜抗性资源的缺乏，对中国萝卜产业可持续发展带来了巨大威胁。根肿菌存在广泛的生理小种分化现象，且抗性基因对不同生理小种具有特异性。甘彩霞等[8]以湖北长阳山区根肿菌对100 份萝卜种质资源进行抗性鉴定评价，发现春不老、重庆冰糖萝卜2 份圆白萝卜材料表现抗病，而笔者的研究中2 份材料分别为高感、感病材料，可能是根肿菌生理小种不同所致。Pang 等[24]利用新建立的根肿菌SCD 鉴定系统，表明来自长阳山区火烧坪的根肿菌生理小种为Pb10（HBHSP-91），来自四川眉山的根肿菌生理小种为Pb3（SCMS-164），进一步证实萝卜不同品种对根肿菌生理小种具有专化抗性，因此筛选多抗种质资源尤为必要。笔者的研究筛选到2 份对根肿菌生理小种Pb3 免疫的萝卜材料，其是否对国内多个根肿菌生理小种具有抗性还需要进一步鉴定。

掌握根肿病抗性遗传规律是抗病材料创制的理论依据。目前，十字花科作物根肿病抗性遗传研究主要集中在白菜（B.rapa）、甘蓝型油菜（B.napus）、甘蓝（B.oleracea）这三大类芸薹属作物中，且在以上3 种作物中抗性遗传基础存在差异。B.rapa根肿病抗性主要是受单个显性主效基因控制的质量性状，B.napus根肿病抗性是由若干个独立的显性基因控制的质量性状，B.oleracea根肿病抗性主要是多基因控制的数量性状[27]。受主效基因或独立显性基因控制的性状更容易进行转育与基因定位研究，至今在大白菜上已定位27 个抗性位点，在油菜上已定位45 个抗性位点，并通过传统或分子标记辅助选育手段培育了大批优秀的白菜、油菜根肿病抗性品种[21，26-27]。然而，有关萝卜根肿病抗性遗传与抗性基因的研究较少，大部分学者认为萝卜根肿病抗性由一对显性主效基因控制[15-19]，与笔者的研究结果一致，而Gan 等[20]认为萝卜根肿病抗性由隐性多基因控制，可能是用于试验的萝卜品种与根肿病生理小种不同所致。

综上所述，萝卜根肿病抗性田间病圃鉴定结果表明，54 份种质资源对根肿病的抗病能力存在差异。抗性萝卜品种主要来自国外，国内大部分品种表现感病。笔者通过抗性遗传规律分析发现免疫材料白雪公主的根肿病抗性基因受一对显性核基因控制，这一材料的获得将加快萝卜根肿病抗性基因的定位、克隆及抗病新品种的培育进程。