基于核桃生理特征变化的越冬冻害监测指标研究*

张 倩，张载勇，吉春容，刘爱玲，陈 雪

（1 中国气象局气象干部培训学院新疆分院，乌鲁木齐 830013）（2 新疆兴农网信息中心，新疆农业气象台）（3 新疆农业大学）

核桃是新疆优质特色林果树种，在新疆栽培历史悠久、种植面积大，主要分布在新疆阿克苏、喀什、和田等地区，核桃已成为当地农民增收、农业经济发展的重要支柱产业[1]。进入21 世纪以来，随着气候变化，冬季异常低温现象频发，果树越冬冻害的风险不断加大。2008 年1 月15 日至2 月中旬，南疆地区罕见的持续低温和异常降雪使林果业遭受严重冻害，核桃、枣幼树受灾面积占新定植的35%以上[2-3]。2011 年1 月的低温，使东疆和南疆地区的林果遭受严重的越冬冻害[4]。越冬冻害已成为影响和制约新疆林果业可持续发展的主要限制性因素。

越冬期冻害是指在越冬期间，由于植物长时间处于0 ℃以下低温而丧失生理活动能力，造成植物受害或死亡的现象[5-6]。严重的冻害不仅会影响果树长势，使整个植株或一些枝条、花芽受冻死亡，还会造成腐烂病、干腐病等病害蔓延，甚至全园毁灭，对果树生产发展带来严重影响[7-8]。研究表明，果树在遭受冻害时，低温会使果树体内水分结冰，而细胞内结冰会给细胞带来致死性损害[9-10]。也有研究表明，冰冻之后的快速解冻会引起果树的死亡[11-12]。因此，研究果树冻害降温过程中其生理特性的变化十分必要。

目前，许多学者已对苹果[13]、梨[14]、猕猴桃[15]、桃[16]等不同果树在低温胁迫下生理指标的变化及其抗寒性进行了系统研究，而在基于核桃生理特征变化以确定越冬冻害监测指标方面还少有研究。本文通过低温处理试验，研究冻害发生过程中核桃枝条叶绿素荧光参数、质膜透性和可溶性糖含量的变化，结合阿克苏地区越冬期间冻害历史灾情资料进行冻害分级，分析冻害致死温度，以确定核桃越冬冻害气象综合监测指标，为有效预警、减轻或避免核桃冻害，推进新疆地区核桃产业发展提供科学依据和指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为当地2 个主栽核桃品种新丰2 号和温185，取自新疆阿克苏红旗坡农场（北纬41°16′，东经80°18′，海拔1 169 m）立地条件和栽培管理水平基本一致的果园。2020 年1 月中旬采用对角线法选择长势相近的5 年生核桃树，每个品种选取15株，每株分别剪取东、南、西、北、中5 个方向长势中庸、粗度均匀、无病虫害的1 年生枝条。2 个品种各剪取75 个枝条，分类贴标签后装入保鲜袋，当日带回乌兰乌苏农业气象试验站实验室开展模拟试验。

1.2 试验设计

用自来水和蒸馏水将取回的核桃枝条冲洗干净，吸干水分后在枝条末端蜡封。将每个品种蜡封的枝条平均分成5 份，其中1 份作为对照（CK），放置于-10 ℃冰箱中保存备用（取样期间果园区域的日平均气温为-10 ℃），其余4 份进行低温处理试验。

统计分析《中国气象灾害大典：新疆卷》[17]记载的1961—2005 年冻害历史灾情资料、阿克苏市1961—2018 年冬季极端最低气温（图1）、2005 年以来灾情直报系统和阿克苏农业气象试验站的冻害灾情调查结果，结果表明，1961—2018 年阿克苏地区冬季共发生17 次冻害，在有冻害发生的年份中极端最低气温-18.6 ℃出现1 次，-21.8～-20.6 ℃出现6 次，-24.2～-23.4 ℃出现8 次，-26.8 ℃出现2 次，极端最低气温持续时间在5～26 h。因此，低温模拟试验共设置-10（CK）、-18、-21、-24、-27 ℃5 个低温梯度和5、12、24 h 3 段低温持续时间。

图1 阿克苏市1961—2018 年冬季极端最低气温

将分装好的核桃枝条放入低温冰箱（日本三洋）中，分别进行-18、-21、-24、-27 ℃的低温处理，降温速度为3 ℃/h，达到要求温度后，分别停留5、12、24 h。低温处理结束后，再以3 ℃/h的速度升温至-10 ℃恢复24 h 后对各指标进行测定。

每次在2 个配置完全相同的冰箱内进行2 个不同温度的低温处理试验。各品种每个低温梯度不同低温持续时间下的处理共5 个枝条，其中3 个枝条进行叶绿素荧光参数和质膜透性的测定，测定后剩余部分和另外2 个枝条进行可溶性糖含量的测定，重复3 次；对照样品在-10 ℃保存环境中分别停留5、12、24 h 后与低温处理的样品同时取样测定。

1.3 测定方法

1.3.1 叶绿素荧光参数测定

叶绿素荧光参数是用于描述植物光合作用机理和光合生理状况的变量或常数[18-19]。从每次低温处理的5 个枝条中取出3 个剪掉蜡封端，横向剥下长约5 cm 的表皮，利用MINI-PAM（德国，WALZ）测定枝条的基础荧光（Fo）和最大荧光产量（Fm）[20]，根据公式计算光系统Ⅱ（PSⅡ）的光能转换效率（Fv/Fm）。

Fv/Fm＝（Fm－Fo）/Fm

1.3.2 质膜透性测定

质膜透性采用电导法测定[21-23]。将枝条剪成0.5 cm 长的茎段，称重0.5 g 放入试管后加20 mL 蒸馏水摇匀3 h，再浸泡3 h 后用SG23 型电导仪测定浸出液的初始电导率（C）；然后将试管封口置于沸水中水浴30 min，自然冷却至室温后放置3 h 测定其电导率（Ck）和蒸馏水电导率（C0），并计算枝条的相对电导率（REC）。

REC（%）=［（C－C0）/（Ck－C0）］×100

根据不同低温强度和持续时间下2 个核桃品种枝条REC 的变化绘制曲线，配合Logistic 方程，计算半致死温度（LT50），从而建立抗寒性鉴定体系。在抗寒研究中，相对电导率拟合Logistic 回归方程为y＝k/（1＋ae-bx）（a、b、k 均＞0），其中，y为细胞伤害率，x为处理温度，k 为细胞伤害率饱和容量，a、b 为方程参数。为确定a、b 的值，将方程进行线性化处理，得ln［（k－y）/y］＝lna－bx，其中令y1＝h［（k－y）/y］，则转化为细胞伤害率（y1）与处理温度（x）的直线方程。通过直线回归的方法求得a、b 值及相关系数R，用曲线的拐点作为半致死温度，即LT50＝lna/b。

1.3.3 可溶性糖含量测定

每个处理中的3 个枝条在经过叶绿素荧光参数和电导率的测定后，剩余部分作为1 次重复，与另外2 个枝条组成3 次重复，放置在烘箱中75 ℃杀青，105 ℃烘干后粉碎，依照李合生等[24]的试验方法，利用蒽酮比色法进行可溶性糖含量的测定[25-26]。

1.3.4 枝条冻害症状的观测与分级

剪取的核桃枝条分别进行-18、-21、-24、-27 ℃的低温处理后，在室温下恢复24 h，以枝条为单位用自封袋包装进行枝条冻害的观测。

1.4 数据处理

采用Excel 和SPSS 19.0 软件进行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 不同低温处理后枝条叶绿素荧光参数的变化

由图2 可知，随着处理温度的降低，相同低温持续时间内2 个核桃品种枝条基础荧光（Fo）均呈先上升后缓慢下降的趋势。2 个核桃品种枝条Fo 在-18 ℃低温处理与CK 之间的差异均不明显，-21、-24、-27 ℃低温处理与CK 之间均存在显著差异，至-21 ℃时2 个核桃品种枝条Fo 均达到最大值，-21～-27 ℃呈缓慢下降趋势，下降幅度低于-18～-21 ℃的上升幅度，说明-18～-21 ℃的低温造成了核桃枝条光系统Ⅱ（PSⅡ）的结构损伤。

图2 低温处理下2 个核桃品种枝条基础荧光（Fo）的变化

进一步分析图2 中不同低温持续时间下的测定结果，随着低温持续时间的延长，相同低温处理下2 个核桃品种枝条Fo 均逐渐上升，说明随着低温持续时间的延长，核桃枝条受损程度不断增加。在相同低温持续时间下，与CK 相比，新丰2 号-18～-27 ℃低温处理持续时间12 h 后Fo 分别上升了4.9%、97.4%、66.5%、49.6%；温185 分别上升了7.0%、67.8%、47.3%、48.7%，其上升幅度总体低于新丰2 号，说明温185 的抗寒性相对较强。

由图3 可知，随着处理温度的降低，相同低温持续时间内2 个核桃品种枝条光能转换效率（Fv/Fm）均呈逐渐下降趋势，与CK 相比，2 个核桃品种-18 ℃低温处理的Fv/Fm 下降幅度较小，-18～-21 ℃低温处理的Fv/Fm 均显著下降，至-27 ℃时Fv/Fm 均达到最低值，但-21～-27 ℃低温处理的下降幅度均低于-18～-21 ℃处理，说明-18～-21 ℃的低温引起了核桃枝条PSⅡ的结构损伤。同时，低温持续时间越长，枝条Fv/Fm 下降幅度越明显。与CK 相比，新丰2 号-18～-27 ℃低温处理持续24 h 后枝条Fv/Fm 分别下降了6.0%、29.4%、48.2%、51.8%；温185 分别下降了2.1%、22.6%、33.1%、48.6%，其下降幅度低于新丰2 号，说明温185 抗寒性相对较强。

图3 低温处理下2 个核桃品种枝条光能转换效率（Fv/Fm）的变化

2.2 不同低温处理后枝条细胞质膜透性的变化

由图4 可知，随着处理温度的降低，相同低温持续时间内2 个核桃品种枝条相对电导率的变化整体呈“S”形趋势。2 个核桃品种-18 ℃低温处理与CK 之间相对电导率增长不明显、枝条质膜透性增加较小，差异不显著。-18～-27 ℃低温处理相对电导率大幅增加，低温处理间存在显著差异。-21～-27 ℃低温处理相对电导率的增速与-18～-21 ℃处理相比有所减缓，表明在-18～-21 ℃核桃枝条细胞发生了明显改变，质膜透性增加，电解质不同程度外渗，细胞和枝条明显受损。

图4 低温处理下2 个核桃品种枝条相对电导率的变化

相同低温处理下，2 个核桃品种枝条的相对电导率均随着低温持续时间的延长不断增加。新丰2号枝条-18 ℃低温处理持续5、12、24 h 后的相对电导率与CK 相比差异均不显著，当温度下降到-21～-27 ℃时，低温持续5、12、24 h 后相对电导率的差异明显增大，且低温持续时间越长相对电导率越大，说明细胞质膜透性增加显著且受损越严重。温185 枝条相对电导率的变化过程与新丰2 号略有不同，-18 ℃低温处理持续5、12、24 h 后相对电导率与CK 相比差异均不显著，当温度下降到-21、-24 ℃时低温持续5、12、24 h 后相对电导率与CK均存在显著差异，-27 ℃低温处理持续12、24 h 的质膜透性较为接近，且均已上升至最大值（图4）。这说明，同一低温处理不同低温持续时间对不同核桃品种的损伤程度存在差异。

同一低温持续时间下，处理温度越低，2 个核桃品种枝条相对电导率均越大，质膜透性增加程度越显著。以低温持续时间24 h 为例，与CK 相比，新丰2 号枝条经过-18～-27 ℃的低温处理后相对电导率分别增加了2.3%、106.3%、148.5%、156.2%；温185 分别增加了6.1%、85.7%、108.7%、135.9%，二者存在差异，说明果树抗寒性不同，质膜透性增加程度有所差异，温185 的抗寒性强于新丰2 号（图4）。

根据相对电导率进行Logistic 方程拟合分析（表1），不同低温持续时间新丰2 号的半致死温度分别为-21.36、-21.75、-22.45 ℃，温185 分别为-21.84、-22.16、-22.62 ℃，说明当温度为-22 ℃左右时，核桃细胞质膜透性增加程度最大，枝条明显受损。

表1 不同核桃品种半致死温度（LT50）的差异

2.3 不同低温处理后枝条可溶性糖含量的变化

由图5 可知，随着处理温度的降低，相同低温持续时间内2 个核桃品种枝条的可溶性糖含量均呈先上升后下降的趋势。2 个核桃品种枝条可溶性糖含量在-18 ℃低温处理与CK 间的差异均不显著，自-18 ℃低温处理开始核桃枝条的可溶性糖含量逐渐上升，至-21 ℃时各处理均达到最高，而后至-27 ℃时可溶性糖含量明显下降，说明核桃枝条可溶性糖含量对-18～-21 ℃的低温较为敏感，进而影响其抗寒性。

图5 低温处理下2 个核桃品种枝条可溶性糖含量的变化

由图5 还可以看出，不同低温持续时间对核桃枝条可溶性糖含量的影响并非正相关关系，低温持续12 h 后枝条可溶性糖含量最高。与CK 相比，新丰2 号在-18～-27 ℃低温处理下持续12 h 枝条可溶性糖含量分别增加了37.8%、274.8%、144.3%、69.1%，温185 分别增加了47.4%、256.7%、192.9%、128.1%，新丰2 号增加幅度和枝条可溶性糖含量总体低于温185，抗寒性相对较弱。

2.4 核桃树越冬冻害综合监测指标的确定

2.4.1 核桃树越冬冻害的生理指标

植物细胞膜受损后会导致透性增加，表现为电解质渗出率的大幅增加，这种低温范围被称为临界低温[27]。低温模拟试验结果表明，不同低温持续时间下，核桃枝条Fo、Fv/Fm、可溶性糖含量对-18～-21 ℃的低温较为敏感，进而影响其抗寒性，说明对核桃枝条是否受损影响较大的临界低温范围为-18～-21 ℃。

半致死温度是指在这个温度上，植物达到半致死状态，当温度继续下降并低于该温度时，植物所受到的损伤将无法恢复甚至死亡。因此，半致死温度越低，植物的抗寒性越强。对2 个核桃品种低温模拟试验的半致死温度进行计算，结果表明，2 个核桃品种枝条的半致死温度均在-22 ℃左右（表1）。

2.4.2 核桃树越冬冻害的气象指标

统计分析1961—2018 年阿克苏地区冬季发生冻害年份的日最低气温，进行百分比排位，占比最高的范围为-19.6～-20.3 ℃。低温模拟试验的分析结果表明，核桃枝条是否受损影响较大的临界低温范围为-18～-21 ℃，通过Logistic 方程计算95%置信区间内所有相对电导率所对应的温度值，其平均值为-20.1 ℃，二者相结合确定-20 ℃可作为阿克苏地区核桃树发生冻害的界限温度。

2.4.3 核桃树越冬冻害的综合监测指标

根据低温模拟试验确定核桃枝条冻害发生的界限温度为-20 ℃，半致死温度为-22 ℃。结合1961—2018 年阿克苏地区冬季冻害发生年份的日最低气温、日最低气温持续时间实况以及历史发生冻害灾情中出现的果树枝条、树干受冻症状，分级标准参照《果树栽培学实验实习指导书》（河北农业大学编）的相关内容，并根据实际观测进行确定，核桃树越冬冻害发生等级综合监测指标采用百分比排位法。最低气温≤-20 ℃并持续3 d 及以上或最低气温≤-24 ℃并持续1 d 及以上时，核桃树枝条可能会出现轻度冻害；当最低气温≤-22 ℃并持续5 d 及以上或最低气温≤-24 ℃并持续3 d 及以上时，核桃树枝条可能出现中度冻害；最低气温≤-24 ℃并持续7 d 及以上时，核桃树枝条可能出现重度冻害（表2）。

表2 核桃树越冬冻害指标等级划分

3 讨论

叶绿素荧光动力学基于光合作用理论，可利用植物体内叶绿素来研究和观测植物光合生理状况及外界因素对其的细微影响[28]，已被广泛运用于植物光合生理生态及胁迫生理生态等研究领域[29]，但很少被应用在核桃低温冻害的研究中。本文将其应用于冬季核桃树离体枝条的观测中，结果表明，随着处理温度的降低，2 个核桃品种枝条的基础荧光（Fo）呈先上升后缓慢下降趋势，光能转换效率（Fv/Fm）呈下降趋势，说明低温造成了核桃枝条光系统Ⅱ（PSⅡ）的结构损伤，这与郑国华等[20]、向春燕[30]对枇杷、苹果的研究结论一致。同时，本研究发现，-18～-21 ℃的低温造成了核桃枝条PSⅡ的结构损伤。

植物细胞质膜是细胞和外部环境的分界面。当植物处于高温、低温、干旱等不良的外部环境时，细胞质膜会受到不同程度的损伤而使质膜透性增大，致使细胞内含物出现不同程度外渗。有研究表明，电导法配合Logistic 方程可进行植物抗寒性分析[22,31]。本研究表明，2 个核桃品种枝条的相对电导率均随着处理温度的降低和低温持续时间的延长呈上升趋势，这与前人研究结果[2,32-33]基本一致。本研究发现，2 个核桃品种-18 ℃低温处理与CK 之间相对电导率差异均不显著，而-21、-24、-27 ℃低温处理与CK 之间均存在显著差异，说明只有下降到某一温度时，枝条细胞的质膜透性才会显著增加。研究还通过Logistic 方程拟合分析2 个核桃品种在不同低温持续时间下的半致死温度均在-22 ℃左右，说明当温度在-22 ℃左右时，核桃细胞质膜透性呈最大程度增加。

可溶性糖含量作为植物体内一种重要的渗透调节物质，在胁迫环境中会发生显著变化[34]。研究表明，可溶性糖含量的变化可作为植物抗寒能力的研究指标[35]。本研究结果表明，随着温度的降低，2个核桃品种枝条的可溶性糖含量呈先上升后下降的趋势。这一变化趋势与枣[2]、酿酒葡萄[6]、扁桃[36]等果树的研究结论一致。同时，本研究发现，枝条可溶性糖含量对-18～-21 ℃的低温较为敏感，温185的枝条在低温持续12 h下各温度处理的可溶性糖含量的增加幅度均高于新丰2 号，说明其抗寒性相对较强。

本文通过分析核桃枝条在低温冻害过程中生理特征的变化，结合新疆阿克苏地区核桃越冬期冻害历史灾情资料，确定核桃越冬冻害综合监测指标。由于低温冻害对果树的影响是一个动态变化的复杂过程，今后还需继续进行更细化的低温试验，测定更多与核桃抗寒性相关的指标。同时，本文主要以核桃1 年生枝条为试验材料，对核桃多年生枝条越冬冻害监测指标的确定还需进行进一步研究。

4 结论

（1）通过低温模拟试验，分析不同低温及低温持续时间下2 个核桃品种新丰2 号和温185 枝条叶绿素荧光参数、质膜透性和可溶性糖含量的变化特征，得出核桃枝条受损温度范围在-18～-21 ℃，核桃树的半致死温度在-22 ℃左右。温185 的抗寒性强于新丰2 号。

（2）低温模拟试验与核桃历史冻害灾情资料、果树枝条及树干受冻症状相结合，结果表明，-20 ℃是阿克苏地区核桃枝条发生冻害的界限温度，并以低温-20、-22、-24 ℃及其持续时间分别构建了核桃树发生不同等级（轻度、中度、重度）越冬冻害的综合监测指标。