黑水虻提取物虫油降低断奶仔猪腹泻率的研究

肖琛闻, 包省军, 王教瑜, 陈金朗, 陈霖, 徐丽华

(1.浙江省农业科学院, 浙江 杭州 310021; 2.浙江昆微农业技术有限公司, 浙江 杭州 311121;3.武义新鑫家庭农场, 浙江 武义 321031; 4.武义县科学技术局, 浙江 武义 321299)

中国是世界最大猪肉生产国与消费国, 据国家统计局公布数据显示, 2022 年全国生猪出栏45 256 万头, 能繁母猪存栏量4 390 万头[1]。生猪养殖一直以来是农民增收的重要来源, 浙江省生猪规模养殖水平居全国前列。

断奶仔猪腹泻是一种多因素疾病[2], 在断奶两周内高发。该病流行面广, 一年四季均可发病,病愈后仔猪生长缓慢, 给我国养猪行业造成严重经济损失。据统计, 在我国, 仔猪断奶后腹泻率甚至可高达50%。断奶应激引起肠道绒毛脱落, 肠黏膜吸收能力降低和渗透性增大, 造成仔猪腹泻或死亡。有研究表明, 日粮中抗原过敏及病原感染是导致断奶仔猪肠道损伤的重要因素[3]。近年来由于抗生素的大量使用, 耐药性病原株日益增多, 给预防和治疗病原感染为主的断奶仔猪腹泻带来了诸多困难。

环保昆虫黑水虻 (black soldier fly) 的幼虫在自然界能以有机物为食物, 具有食性杂、食量大、生长迅速等特点, 已被欧美国家引入环保建设中。黑水虻的昆虫体内还含有多种抗微生物的活性成分[4], 可以增强动物抵抗力, 减少畜禽养殖业中抗生素的使用, 有利于建立健康的畜禽养殖模式。本项目前期研究表明, 黑水虻提取物能够显著抑制肠道致病菌的生长, 同时对家畜肠道细胞生长具有促进作用, 因此具有较好的推广应用价值[5]。本文探究黑水虻提取物 (black soldier fly extraction,BFE) 对断奶仔猪生产性能、免疫功能及断奶后腹泻率的影响, 以及BFE 对仔猪肠道绒毛生长是否有改善作用。利用BFE 在生猪健康养殖中开展试验, 努力使抗生素使用大幅下降, 为浙江省生猪健康养殖提供可持续发展的新产品和新技术。

1 材料与方法

1.1 黑水虻提取物BFE 提取方法

清洗0.5 h, 通过机器将黑水虻虫卵清洗干净;清洗后投入蒸煮锅中, 蒸煮30 min; 蒸煮后的黑水虻通过螺旋, 提升出水滤干并输送至破壁压榨系统, 进行压榨处理, 进而得到虫浆混合物和固渣虫皮; 得到虫浆混合物后, 输送至三相离心机进行油、水、渣的分离, 进而获得虫油, 黑水虻提取物(虫油) BFE。

1.2 断奶仔猪饲喂BFE

选取杜长大外三元母猪所产仔猪, 在仔猪断奶后开始在饲料中添加2% BFE, 连续饲喂1 个半月, 前腔静脉采集抗凝血。分离血清, 饲喂BFE 2个半月进行称重, 并计算出平均增重。

1.3 猪瘟病毒 (CSFV) 抗体检测结果

实验组和对照组各采集10 头仔猪, 前腔静脉采血, 采用猪瘟病毒抗体 ELISA 检测试剂盒(IDEXX 产品) 进行检测。该试剂盒是用猪瘟病毒抗原包被的微量反应板, 利用阻断ELISA 原理来检测猪血清或血浆中猪瘟病毒抗体。具体方法参考说明书。

1.4 测定血液中细胞因子

采用RayBiotech 公司产品芯片, 测定血清中细胞因子 (IL-1β、IL-10、TNFα), 并对芯片的数据进行分析。具体方法参考QAP-CYT-1 芯片操作流程。

1.5 测定血液中的mRNA 表达

从实验组和对照组各采集10 头仔猪采集凝血样品, 血液RNA 提取采用 PureLink RNA Mini 试剂盒 (life technologies, USA)。采用Sybgreen 染料法进行实时PCR 测定[6], 测定IFN-α、IL-10、IL-12、IL-4、IL-6 的表达情况。所用的基因引物根据猪相关基因序列设计,Actin作为内参基因。2-ΔΔCT是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。

1.6 测定肠绒毛和隐窝深度

实验组和对照组各选取5 头仔猪, 采集断奶仔猪空肠, 放入固定液中, 采用苏木精-伊红染色法(HE) 进行肠道组织切片。通过组织处理和石蜡切片的HE 染色得到切片。采用软件Caseviewer 对图片进行分析对比。并对肠绒毛和隐窝深度进行测定,最后再计算肠绒毛和隐窝深度比值。

2 结果与分析

2.1 断奶仔猪平均增重

饲喂BFE 2 个半月进行称重, 并计算出平均增重。结果表明, BFE 饲喂的实验组平均增重显著高于对照组, 平均增重率9.79% (图1)。饲喂组仔猪毛色相比对照组更光亮, 毛发更滑顺, 精神更佳。说明饲喂BFE 一定时间可以显著提高仔猪生长水平。

图1 不同处理仔猪平均增重

2.2 猪瘟病毒 (CSFV) 抗体检测结果

于仔猪断奶后20 d 注射免疫猪瘟CSFV 活疫苗(传代细胞源, 中牧实业股份有限公司), 同时饲喂2% BFE 一个半月, 免疫疫苗40 d 以后, 仔猪的CSFV 抗体水平显著高于对照组, 说明BFE 能够显著提高断奶仔猪对于商品化疫苗的免疫反应水平(图2)。

2.3 断奶仔猪血清中细胞因子水平

BFE 饲喂一个半月, 仔猪血清中的细胞因子水平 (IL-1β、IL-10、TNFα) 显著高于对照组,其余指标并没有显著性差异, 说明BFE 能够显著提高断奶仔猪的细胞免疫反应水平 (图3)。

图3 不同处理断奶仔猪的细胞免疫反应水平

2.4 断奶仔猪血液RNA 细胞因子表达水平

2%BFE 饲喂一个半月, 仔猪血液中的细胞因子表 达 水 平 (IFN-α、IL-10、IL-12、IL-4、IL-6)显著高于对照组, 说明BFE 能够显著提高断奶仔猪的细胞免疫反应水平 (图4)。

图4 不同处理断奶仔猪的细胞因子表达水平

2.5 BFE 添加剂对断奶仔猪空肠绒毛和隐窝深度的影响

对空肠进行采样, 进行组织切片, 发现2%BFE 添加剂可明显改善空肠内肠绒毛长度与厚度(图5)。说明2%BFE 添加剂可促进仔猪肠道生长,避免因肠道发育不良导致的仔猪腹泻。

图5 不同处理仔猪空肠绒毛长度与隐窝深度

2.6 BFE 对断奶仔猪腹泻的影响

确定断奶仔猪饲料添加BFE 方案 (即2%BFE添加剂在仔猪上的应用, 连续饲喂1 个月以上),通过生猪养殖场-武义新鑫家庭农场试验评估, 根据腹泻情况判断仔猪腹泻头数, 结果发现, 使用BFE 试验组, 可降低仔猪腹泻率10 百分点 (对照组每100 头中20 头腹泻, 实验组每100 头中10 头腹泻), 从原来的20%腹泻率降低为10%, 因此,BFE 对于预防仔猪断奶腹泻具有较好的应用前景和巨大的市场空间。

3 讨论

仔猪断奶腹泻是规模化养猪出现的主要问题之一, 如何有效降低仔猪腹泻对于提高养猪效益至关重要。本研究应用一种黑水虻提取物虫油, 开展断奶仔猪的腹泻防控研究。黑水虻虫油作为一种生物制剂, 没有抗生素残留的风险, 能够显著提升仔猪的免疫力和生产性能, 对于肠道发育有明显促进作用。这对于将来应用推广该种黑水虻虫油具有重要的意义。

从仔猪增重试验结果来看, 饲喂BFE 一定时间可以显著提高仔猪生长水平, 提高仔猪的免疫水平, 对于特定病原的商品化疫苗也具有较好的免疫促进效果。IL-1β 作为一种关键的促炎细胞因子[7], 参与多种自身免疫性炎症反应和多种细胞活动, 包括细胞增殖、分化和凋亡。IL-1β 对几乎所有组织的细胞防御和组织修复至关重要, 与疼痛、炎症和自身免疫有关。IL-1β 通过非常规的蛋白质分泌途径分泌, 可以旁分泌或系统分泌, 主要由先天免疫系统的前哨细胞: 单核细胞和巨噬细胞产生, 也可以从上皮细胞、成纤维细胞、滑膜细胞、神经元、肥大细胞以及胶质细胞如小胶质细胞和星形胶质细胞等释放, 来源较为广泛。白介素10 (IL-10) 是一种多细胞源、多功能的细胞因子[8], 参与炎性反应和免疫反应。肿瘤坏死因子α(TNFα) 主要由活化的单核/巨噬细胞产生[9], 能杀伤肿瘤细胞, 促进中性粒细胞吞噬, 是重要的炎症因子, 参与某些自身免疫病的病理损伤。BFE饲喂一个半月, 仔猪血清中的细胞因子IL-1β、IL-10、TNFα 水平显著提高, 表明BFE 能提高仔猪先天免疫系统的免疫水平、提高调节细胞的生长与分化、参与炎性反应和免疫反应的能力、促进杀伤和抑制肿瘤细胞生成。因此, 也提示BFE 可作为仔猪断奶至成熟期间的一种候选免疫增强剂, 有利于仔猪断奶后的生长保护, 促进断奶仔猪的健康生长, 提高生产效益。

猪的肠道形态尤其是绒毛的长度和隐窝深度,是表征猪肠道健康的重要指标。绒毛边缘可分泌多种消化酶, 因此, 绒毛越长, 动物的消化吸收能力越强。隐窝深度决定肠绒毛有丝分裂生成上皮细胞的速度, 反映细胞生成率, 而隐窝变浅, 表明细胞成熟率上升, 分泌功能增强[10]。有研究对仔猪消化器官 (空肠) 形态结构 (不同日龄仔猪空肠组织结构) 进行观察, 结果表明, 绒毛越长、越粗,表面积越大, 对营养的消化吸收越有利。本研究中的试验组仔猪空肠绒毛的长度和隐窝深度显著高于对照组, 说明虫油能够显著促进仔猪断奶后肠道发育, 对于保护断奶仔猪腹泻具有显著作用, 这为虫油在断奶仔猪推广应用积累了较好的科学数据。虫油在断奶仔猪腹泻率防控上具有推广应用价值。