超高效液相色谱-串联质谱法同时测定党参和当归中23种植物生长调节剂的残留量

刘志荣,张明童,马 潇,谢 楠,郭朝晖,杜海娟

(甘肃省药品检验研究院 甘肃省中藏药检验检测技术工程实验室 国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室,兰州 730070)

植物激素对于植物生长发育具有非常重要的作用,几乎调控着植物生命过程的各个方面,如植物的生长发育以及对生物和非生物的应激反应等。植物激素分为天然植物激素和植物生长调节剂(PGRs),PGRs又被称为外源性植物激素,属于合成农药,具有与天然植物激素相似的生物活性,能有效地促进、抑制或改变植物的生长发育过程[1-2]。PGRs可被单独使用,也可被组合使用,能增加农作物产量和提高农作物品质[3-4]。PGRs也会带来一些危害,如作物收获阶段残留的PGRs,如多效唑、矮壮素等不能被吸收或降解,进而可能对人和环境产生危害[5-7]。近年来,中药材种植中PGRs过量使用的现象越来越普遍,而中药材中PGRs残留限量标准尚未制定,导致中药材中PGRs 的残留问题越来越受人关注[8-11]。中药材成分复杂,PGRs的物理化学性质也较为复杂,因此开发中药材中PGRs多残留同时检测的方法具有一定的挑战性。本工作通过优化前处理、色谱、质谱条件,建立了超高效液相色谱-串联质谱法(UHPLC-MS/MS)同时测定党参、当归中23种PGRs残留量的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

LC-30AD 型液相色谱仪;AB SCIEX QTRAP 5500型三重四极杆质谱仪;5418R 型高速离心机;MS 3型涡旋振荡器;XPR205型电子天平;Milli-Q型纯水系统。

单标准储备溶液:1 g·L－1,取23种PGRs标准品各10 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL,于－20 ℃储存。

单标准中间液:10 mg·L－1,取各单标准储备溶液适量,用乙腈稀释而成。

混合标准溶液系列:取适量单标准中间液,用50%(体积分数,下同)乙腈溶液逐级稀释,配制混合标准溶液系列,各PGRs的浓度点见表1。参考上述步骤,以空白样品溶液作稀释剂配制基质匹配混合标准溶液系列。

标准品:胺鲜酯质量分数97.6%,批号D0 009326;烯效唑质量分 数 99.8%,批 号D0 009823;氯吡脲质量分 数 98.8%,批号D0 009378;6-苄基氨基嘌呤质量分数99.2%,批号C0 008824;6-糠氨基嘌呤质量分数98.8%,批号D0 009286;抑芽唑质量分数 99.7%,批号D0 009876;多效唑质量分数 96.6%,批号D0 009887;3-吲哚乙酸质量分数98.2%,批号23519;矮壮素质量分数99.6%,批号G 738578;丁酰肼质量分数99.5%,批号D0 009824;抗倒酯质量分数99.8%,批号D0 009825;吲熟酯质量分数97.2%,批号D0 010273;4-氯苯氧乙酸质量分数98.6%,批号D0 009863;2,4,5-涕质量分数97.9%,批号D0 009875;2-萘氧乙酸质量分数98.4%,批号23627;5-硝基愈创木酚钠质量分数98.4%,批号24341YM;2,3,5-三碘苯甲酸质量分数96.6%,批号D0 009326;赤霉素质量分数98.4%,批号D0 009834;4-硝基苯酚钠质量分数98.4%,批号D0 009839;3-吲哚丁酸质量分数98.1%,批号23525;2,4-滴质量分数99.5%,批号D0 009844;噻苯隆质量分数99.5%,批号25991;助壮素质量分数98.5%,批号23899。

甲醇、乙腈为色谱纯;无水硫酸镁(AMS)和氯化钠为优级纯;N-丙基乙二胺(PSA)填料粒径为40～60μm;十八烷基硅烷键合硅胶(C18)粒径为40～70μm、石墨化碳黑(GCB)粒径为40～70μm;试验用水为超纯水。

46批党参样品收集于甘肃岷县和文县地区,30批当归样品收集于甘肃岷县、渭源县以及陇南地区,76批样品均由甘肃省药品检验研究院主任中药师马潇鉴定。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱条件

Waters AQUITY UPLC BEH Shield RP18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm);柱温40 ℃;流动相A 为含5 mmol·L－1甲酸铵的0.05%(体积分数,下同)甲酸溶液,B 为含5 mmol·L－1甲酸铵和0.05%甲酸的乙腈溶液;流量0.3 mL·min－1;进样量5μL。梯度洗脱程序:0～1.0 min时,A 为70%;1.0～7.0 min时,A 由70%降至5%;7.0～8.0 min时,A 由5%升至70%,保持2.0 min。

1.2.2 质谱条件

电喷雾离子(ESI)源,正(ESI＋)、负(ESI－)离子模式;保留时间依赖多反应监测(s MRM)模式。

ESI＋模式:离子源电压5 500 V;离子源温度500 ℃;气帘气压力241 kPa;喷雾气压力345 kPa;加热气压力345 kPa。

ESI－模式:离子源电压－4 500 V。其他参数同ESI＋模式。

其他质谱参数见表2。

表2 质谱参数Tab.2 MS parameters

1.3 试验方法

样品经晾干,反复粉碎后过65 目(250μm±9.9μm)筛。取3.0 g样品粉末,置于50 mL 聚丙烯离心管中,加入1.0%(体积分数)冰乙酸溶液5 mL,涡旋使样品完全浸湿。浸泡30 min 后加入乙腈15 mL,以500 次·min－1速率剧烈 振摇10 min。将AMS 4.0 g和氯化钠1.0 g加至上述离心管中,先剧烈摇散,防止盐结块,然后以500 次·min－1速率剧烈振摇10 min,以5 000 r·min－1转速离心10 min。收集全部上清液,转移至15 mL 离心管中,于40℃氮吹至近干,加入50%乙腈溶液1 mL溶解残渣,按照优化的仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

用针泵将500μg·L－1单标准溶液以10μL·min－1流量注入质谱仪,进行一级质谱扫描,其中12种目标物在ESI＋模式下响应较好,对应的母离子多为[M＋H]＋;其他11种目标物在ESI－模式下响应较好,对应的母离子多为[M－H]＋。对母离子进行二级质谱扫描,选择信号强度较高且更稳定的子离子作定量和定性离子,并对去簇电压和碰撞能量进行手动模式优化,优化后的质谱参数见表1。

2.2 色谱条件的优化

流动相的组成会影响目标物的峰形、分离度、信号强度等。因此,试验考察了分别以甲醇、乙腈作有机相,水、甲酸溶液、甲酸铵溶液作水相时对各目标物分离效果的影响。结果显示:以乙腈作有机相时,各目标物的分离度整体优于以甲醇作有机相时的;以水作水相时,各目标物的响应均较好,但是ESI－模式下3-吲哚乙酸、3-吲哚丁酸、2-萘氧乙酸、2,4,5-涕等酸性PGRs的峰形较差;以甲酸溶液作水相时,上述4种目标物的峰形得到明显改善,且甲酸体积分数为0.05%,0.1%,0.2%时各目标物的分离效果相差不大;在甲酸溶液和乙腈中加入5 mmol·L－1甲酸铵时,23种目标物的峰形较加甲酸铵前的明显改善,ESI＋模式下大多数目标物的信号强度随着流动相中甲酸铵浓度的增加而增大,ESI－模式下大多数目标物的信号强度随流动相中甲酸铵浓度增加而减小,但ESI－模式下各目标物的信号强度均较小,甲酸铵浓度的影响并不显著。综合考虑,试验选择的水相为含5 mmol·L－1甲酸铵的0.05%甲酸溶液,有机相为含5 mmol·L－1甲酸铵和0.05%甲酸的乙腈溶液。

2.3 提取溶剂的选择

在采用乙腈提取样品中目标物时,需先加入适量水润湿样品,从而使乙腈穿透样品,将样品内部的目标物提取出来。试验比较了乙腈和水的体积比分别为2∶1、3∶1、4∶1 时加标党参样品(加标量0.5μg·g－1)中各目标物的回收率。结果显示:上述3种体积比下目标物的回收率为70.0%～120%,其中助壮素和矮壮素的回收率随着乙腈占比的增加而增大,其他21种目标物的回收率变化不大。综合考虑回收率和易操作性,试验选择乙腈和水的体积比为3∶1。

考虑到酸化的提取溶剂有利于酸性目标物的提取,试验采用冰乙酸溶液5 mL＋乙腈15 mL提取,比较了冰乙酸溶液的体积分数分别为0,0.5%,1.0%,2.0%,3.0%时对加标党参样品(加标量0.5μg·g－1)中酸性目标物回收率的影响,结果见图1。

图1 冰乙酸溶液体积分数对酸性PGRs回收率的影响Fig.1 Effect of volume fraction of glacial acetic acid solution on the recovery of acid PGRs

由图1可知,冰乙酸溶液体积分数为1.0%时,加标样品中酸性目标物的回收率整体较高,冰乙酸溶液体积分数继续增加,各目标物的回收率变化不大。因此,试验选择冰乙酸溶液的体积分数为1.0%。

2.4 净化过程的影响

在净化样品提取液时,通常将吸附剂(PSA、GCB、C18等)和AMS组合使用,有利于去除提取液中的共提取物和水分,提高目标物的回收率。其中:吸附剂PSA 主要用于吸附有机酸、糖类和色素等杂质,但也会吸附酸性目标物;GCB 主要用于吸附类胡萝卜素、叶绿素和甾醇类等杂质,但也会吸附具有平面型结构的目标物;C18主要用于吸附脂类、固醇类和其他复杂化合物,但也会吸附部分亲脂性目标物。按照试验方法提取加标党参样品(加标量0.5μg·g－1),离心后在上清液中加入不同组合吸附剂[450 mg AMS(组合A1),450 mg AMS＋200 mg C18(组合A2),450 mg AMS＋200 mg PSA(组合A3),450 mg AMS＋200 mg C18＋200 mg PSA(组合A4),450 mg AMS＋200 mg C18＋200 mg PSA＋50 mg GCB(组合A5)],以500次·min－1剧烈振摇5 min,5 000 r·min－1离心10 min后,收集上清液,后续处理步骤同试验方法,比较了在上述5种吸附剂分组下23种PGRs的回收率,结果见图2。

图2 吸附剂对23种PGRs回收率的影响Fig.2 Effect of adsorbent on the recovery of the 23 PGRs

由图2可知:A1、A2组合所得23种PGRs的回收率在70.0%～120%内,均能满足痕量分析的要求;A3、A4组合中存在PSA,PSA 对2,4-滴、2-萘氧乙酸、4-氯苯氧乙酸和2,3,5-三碘苯甲酸等目标物的亲和力较强,导致这4种目标物的回收率均低于40.0%;A5组合中不仅存在PSA,还存在GCB,GCB对6-苄基氨基嘌呤、6-糠氨基嘌呤、噻苯隆和氯吡脲的亲和力较强,导致这4种目标物的回收率均低于30.0%。A1、A2组合虽然均能满足痕量分析的要求,但是A2组合所得矮壮素、助壮素的回收率分别为70.9%和70.4%,回收率相对较低。考虑到A1、A2 组合所得回收率结果与不净化时的(70.0%～120%)基本一致,试验选择不加吸附剂。由于提取液未采用吸附剂净化,仪器污染风险加大,需要缩短仪器维护周期,以延长仪器使用寿命。

2.5 基质效应

基质效应(ME)是指样品提取液中的共提取物对目标物测定的影响。在痕量分析中,基质效应对分析结果准确度的影响无法忽略,可通过计算同浓度水平基质匹配标准溶液和标准溶液中目标物峰面积的百分比(ME 值)来评价。一般认为:ME 值在85%～115%内时基质效应较弱,对分析结果准确度影响较小,可忽略[9,12];如果超过了上述范围,则说明基质效应不能忽略。按照试验方法处理党参、当归空白样品,分别以空白样品溶液和50%乙腈溶液作稀释剂,配制对应的混合标准溶液,按照仪器工作条件测定。结果显示,党参和当归基质中有78.3%目标物的ME 值不在85%～115%内,说明大部分目标物的基质效应无法忽略。为了降低基质效应的影响,试验采用基质匹配法定量。

2.6 工作曲线和测定下限

按照试验方法测定基质匹配混合标准溶液系列,以各目标物的质量浓度为横坐标,其对应的定量离子的峰面积为纵坐标绘制工作曲线。结果显示,党参和当归基质中各目标物的质量浓度均在一定范围内(表3)和对应的峰面积呈线性关系,工作曲线的相关系数均不小于0.990 0。以10倍信噪比(S/N)计算测定下限(10S/N),结果见表3。

表3 线性范围和测定下限Tab.3 Linear ranges and lower limits of determination

2.7 精密度和回收试验

按照试验方法分别对党参、当归空白样品进行低、中、高等3个浓度水平(3,10,50μg·kg－1)的加标回收试验,每个浓度水平平行测定5次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)。结果显示,23种PGRs在党参、当归两种基质中的回收率为75.2%～109%,测定值的RSD 为1.8%～13%,满足痕量分析要求。

2.8 样品分析

按照试验方法分析收集到的46批党参和30批当归样品,结果显示:3-吲哚乙酸、矮壮素、多效唑、4-硝基苯酚钠、5-硝基愈创木酚钠等5 种PGRs被检出,其中3-吲哚乙酸、4-硝基苯酚钠、5-硝基愈创木酚钠在所有样品中几乎均被检出且检出量较大,其他两种PGRs检出量均较低。3-吲哚乙酸毒性较低且植物能够微量产生,5-硝基愈创木酚钠已被联合国粮农组织推荐为绿色食品工程PGRs,这两种PGRs的检出情况无需关注;4-硝基苯酚钠在党参和当归中的检出量分别为19.6～169.3μg·kg－1和13.6～191.4μg·kg－1。参考GB 2763－2021《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》对蔬菜或水果中复硝酚钠(5-硝基邻甲氧基苯酚钠、邻硝基苯酚钠和4-硝基苯酚钠)残留限量(100μg·kg－1)的规定,有5批党参(检出率10.9%)、2 批当归(检出率6.7%)中4-硝基苯酚钠的残留量超标。这是由于种植时使用了复硝酚钠类PGRs产品,而4-硝基苯酚钠在自然界中难以降解,进一步被作物吸收,导致作物中4-硝基苯酚钠残留量超标。

本工作通过优化前处理条件和仪器工作条件,提出了UHPLC-MS/MS 同时测定党参、当归中23种PGRs残留量的方法。该方法简单、准确、可靠,符合痕量分析要求,可为中药材中PGRs残留量的测定提供参考。党参和当归中均存在4-硝基苯酚钠超标现象,下一步应加强该方面的监管,并开展PGRs对中药材质量影响的研究。