基于CuB(C6 H5)4 缔合物微粒体系的共振散射光谱法测定异烟肼药片中异烟肼的含量

孙双姣,唐雅婷

(邵阳学院 药学院,邵阳 422000)

结核病是伴随人类历史最久,造成人类死亡最多的慢性传染病。尽管我国结核病防治工作取得了很好的成效,但结核病感染形势还较为严峻,结核病仍然是威胁人民群众健康的重大传染性疾病[1]。异烟肼(INH)是治疗结核病的首选药物,能抑制结核杆菌生长,抗菌作用强[2]。因此,进行INH 质量监控及用药安全监测具有重要的意义。目前,已报道的INH 检测方法主要有高效液相色谱法[3-5]、分光光度法[6-7]、荧光法[8]、气相色谱法[9-10]、毛细管电泳法[11]、化学发光法[12-15]、电化学法[16-17]等。这些方法有的操作繁琐费时,有的仪器昂贵,有的仪器灵敏度不高。共振散射光谱法具有仪器简单、操作方便、灵敏度高的特点,已广泛应用于无机[18-19]、生化[20-21]、药物[22-24]等领域。

INH 结构中的酰肼基具有较强的还原性,可与氧化物发生反应。本工作利用INH 将Cu(Ⅱ)还原为Cu(Ⅰ),Cu(Ⅰ)继续与NaB(C6H5)4作用生成CuB(C6H5)4缔合物,并进一步聚集成缔合微粒,产生固液界面,引起体系共振光散射信号强度显著增大,在397 nm 处形成强共振散射峰,该共振散射峰信号强度与INH 质量浓度在一定范围内成正比,由此建立了共振散射光谱法测定INH 药片中INH 含量的方法。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

F97pro型荧光分光光度计;VM-210 型混合器;H2-16KR 型台式高速冷冻离心机;FA2004 型电子天平。

INH 标准溶液:1.00 g·L－1,批号为100578-201502。

INH 标准中间液:20 mg·L－1,取适量INH 标准溶液,用水稀释,摇匀备用。

INH 标准溶液系列:取适量INH 标准中间液,用水逐级稀释,配制成INH 质量浓度分别为0.010,0.050,0.100,0.500,1.00,1.50,2.00 mg·L－1的INH 标准溶液系列。

所用试剂均为分析纯;试验用水为二次蒸馏水。

INH 药片分别来自天津的一家制药公司(批号1803010)和山西的两家制药公司(批号分别为G171106和180201)。

1.2 试验方法

取10片INH 药片,研细,混匀,分取含2.00 mg INH 药粉,加入20 mL水,玻璃棒搅拌2 min,所得溶液用水定容至100.0 mL。分取5.00 mL 上述溶液置于10.0 mL离心管中,以10 000 r·min－1转速离心2 min,分取上清液1.00 mL,用水定容至10.0 mL,即制得INH 样品溶液。取1.00 mL 0.20 mol·L－1乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH 4.6)、1.50 mL 0.50 g·L－1NaB(C6H5)4溶 液、2.00 mL 1.00 g·L－1CuSO4溶液至10.0 mL 比色管中,混匀后加入1.00 mL INH 样品溶液,用水定容至10.0 mL,振荡0.5 min,静置反应10 min。取适量上述溶液置于荧光分光光度计中,在200～700 nm内同步扫描激发(λex)、发射(λem)波长(λem＝λex),读取397 nm 处共振散射峰的信号强度IRSS。同步测试试剂空白,得到I0RSS,以ΔIRSS(ΔIRSS＝IRSSI0RSS)进行定量。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

当反应体系中含有0,0.010,0.500,1.00,2.00 mg·L－1INH 时的共振散射光谱见图1。

图1 添加了不同量INH 后反应体系的共振散射光谱Fig.1 Resonance scattering spectra of reaction systems after adding INH with different amounts

由图1可知:当反应体系中不含INH 时,共振散射信号强度很弱(曲线1);加入INH 后,共振散射信号强度显著增强,且随着INH 质量浓度的增加而增强(曲线2～曲线5),强度较大的两个共振散射峰出现在397,467 nm 处。考虑到397 nm 处的共振散射峰信号强度最大,因此试验选择采用397 nm处的共振散射峰进行后续分析。

2.2 缓冲溶液酸度及用量的选择

反应体系酸度会直接影响INH 对Cu(Ⅱ)的还原及CuB(C6H5)4缔合物的生成,从而影响INH 的测定,试验选择采用缓冲溶液控制反应体系的酸度。考虑到Cu(Ⅱ)在碱性环境中会发生水解,试验选择采用酸性的乙酸-乙酸钠缓冲溶液,并优化了其酸度和用量,结果见图2。

图2 不同酸度和用量的乙酸-乙酸钠缓冲溶液下反应体系的ΔIRSSFig.2 ΔIRSS of reaction systems with different acidity and amounts of acetic acid-sodium acetate buffer solutions

由图2可知,反应体系的ΔIRSS在乙酸-乙酸钠缓冲溶液酸度达到pH 4.6以及用量达到1.00 mL时较大,因此试验选择在此条件下进行后续分析。

2.3 CuSO4 与NaB(C6 H5)4 溶液用量的选择

CuSO4与NaB(C6H5)4溶液用量直接影响CuB(C6H5)4缔合物的生成,从而影响方法的灵敏度,因此试验优化了CuSO4与NaB(C6H5)4溶液用量,结果见图3。

图3 不同用量CuSO4 和NaB(C6 H5)4 溶液下反应体系的ΔIRSSFig.3 ΔIRSS of reaction systems with different amounts of CuSO4 solution and NaB(C6 H5)4 solution

当由图3可知,反应体系的ΔIRSS在CuSO4溶液用量达到2.00 mL 以及NaB(C6H5)4溶液用量达到1.50 mL 时较大,因此试验选择在此条件下进行后续分析。

2.4 试剂加入顺序的影响

改变乙酸-乙酸钠缓冲溶液、CuSO4溶液、NaB(C6H5)4溶液以及INH 样品溶液(INH 标准溶液)的加入顺序,发现上述试剂的加入顺序对反应体系ΔIRSS的影响不大。综合考虑,试验选择按照1.2节顺序加入上述试剂。

2.5 静置反应时间的选择

添加一定量INH 标准溶液,使反应体系中INH 的加标量达到0.200,1.00 mg·L－1,按照试验方法分别测定,考察了静置反应时间分别为2,5,8,10,12,15,20,25,30 min时对INH 回收率的影响。结果显示:当静置反应时间不大于10 min时,两种加标量下INH的回收率均随着静置反应时间的延长而增加;当静置反应时间为10～30 min时,两种加标量下INH 的回收率均较大(97.8%～102%)且趋于稳定。综合考虑,试验选择的静置反应时间为10 min。

2.6 共存物质的影响

添加一定量INH 标准溶液,使反应体系中INH 的质量浓度达到1.00 mg·L－1,添加不同INH 量倍数的常见药物辅剂淀粉、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖以及干扰离子NO3－、Cl－、K＋、Zn2＋,考察了这些物质对INH 测定的影响。结果显示,在测定值相对误差绝对值不大于5.0%条件下,100倍淀粉、120倍葡萄糖、150 倍麦芽糖、200 倍蔗糖、600 倍NO3－,800倍Cl－、1 000倍K＋、800倍Zn2＋不干扰INH 的测定。

2.7 标准曲线和检出限

按照试验方法测定INH 标准溶液系列,以INH 的质量浓度为横坐标,对应的反应体系ΔIRSS为纵坐标绘制标准曲线。结果显示:INH 标准曲线的线性范围为0.010～2.00 mg·L－1,线性回归方程为y＝419.9x＋247.6,相关系数为0.999 3。

按照试验方法平行测定11次试剂空白,以3倍标准偏差(s)和标准曲线斜率(k)的比值计算检出限(3s/k),结果为0.004 mg·L－1。

2.8 样品分析

按照试验方法分析3个实际样品,每个样品平行测定5次,计算测定值的相对标准偏差(RSD),并对其进行加标回收试验,计算回收率;参考《中华人民共和国药典》(2020 年版)中高效液相色谱法(HPLC)分析这3 个样品。上述试验所得结果见表1。

表1 样品分析结果(n＝5)Tab.1 Analytical results of the samples(n＝5)

由表1可知:本方法所得INH 的测定值和药典方法的基本一致,均和标签值吻合;测定值的RSD为1.8%～2.6%,回收率为97.0%～99.0%,表明本方法的准确度、精密度好,能用于异烟肼药片中INH 含量的测定。

基于INH 的还原能力建立了共振散射反应体系,利用荧光分光光度计进行定量,实现了INH 药片中INH 含量的测定。方法具有简单、快速、灵敏度高、操作方便、抗干扰能力强等特点,具有一定的应用推广价值。