超声辅助酶法制备沙棘果渣膳食纤维及其功能特性研究

吕孟玲，唐祯玥，张雨松，邵美丽

（东北农业大学食品学院 哈尔滨 150030）

沙棘果渣是沙棘果经榨汁后的副产物，仅有少量用于饲料行业，大部分直接丢弃，造成资源浪费及环境污染。沙棘果渣含有氨基酸、维生素、黄酮类化合物及膳食纤维等多种营养素[1]，目前研究主要集中于黄酮类、沙棘油及花青素等方面，而膳食纤维尚未被开发利用。膳食纤维被誉为人类第七大营养素[2]，具有极强的水合性质，可以增加人体饱腹感，控制食物的摄取，促进排便，能有效预防肥胖和便秘等健康问题；同时膳食纤维具有多种活性基团，可以吸附NO2-、丙烯酰胺等物质，减少食品加工中有毒、有害物质对人体的危害[3-4]。

膳食纤维提取方法主要有水提法、化学提取法、酶提法等。水提法工艺简单，提取率低；化学法使用大量的强酸和强碱，对环境造成污染；酶提法虽然操作条件温和、节约能源、无污染，但是提取效率低[5-6]。近年来超声波技术已成功应用于各种活性物质的提取工艺中。研究发现超声辅助提取不仅能够改变植物多糖微观形态，增加抗氧化能力[7-8]，改善胶原蛋白的溶解性，提高体外消化过程的酶解效率[9]，还能够增加膳食纤维的提取效率，改善膳食纤维的理化性能[10]。

本研究采用超声辅助酶法提取沙棘果渣膳食纤维，对提取工艺进行单因素和响应面试验优化，提高膳食纤维得率。对总膳食纤维、不溶性膳食纤维及可溶性膳食纤维进行理化性质、结构特性和功能性质分析，为深入研究沙棘果渣膳食纤维功能及资源再利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙棘（品种：深秋红），黑龙江牡丹江；碱性蛋白酶，北京奥博星生物科技有限公司；丙烯酰胺，美国Amresco 公司；玉米赤霉烯酮，大连美伦生物技术有限公司；脱氧雪腐镰刀菌烯醇，阿拉丁生化科技股份有限公司；无水乙醇、石油醚等均为国产分析纯。

1.2 设备与仪器

小型高速多功能粉碎机，浙江永康市红太阳机电有限公司；KQ-400KDB 数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；S-3400N 扫描电子显微镜，日本日立；1260II Prime 高效液相色谱仪，美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘果渣基本成分的测定 分别参照GB 5009.3-2010 《食品安全国家标准 食品中水分的测定》、GB 5009.4-2010《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》、GB 5009.5-2016 《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》、GB 5009.6-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》、GB 5009.88-2014 《食品安全国家标准 食品中膳食纤维的测定》对沙棘果渣基本成分进行测定。

1.3.2 沙棘果渣膳食纤维制备

1.3.2.1 沙棘果渣预处理 将沙棘果渣置于60℃热风干燥箱中干燥24 h 后，去除其中的沙棘籽等杂质，采用小型粉碎机粉碎，过60 目筛得到粉末样品，称取定量的粉末样品用索式抽提装置脱脂8 h 后干燥备用。

1.3.2.2 沙棘果渣膳食纤维制备工艺 称取一定量的脱脂沙棘果渣样品于烧杯中，设置不同的提取工艺参数（料液比、pH 值、酶解温度、碱性蛋白酶添加量、超声功率和超声时间）进行膳食纤维提取，提取结束后，于100 ℃水浴中保温15 min。将提取液离心，然后分别用70 ℃去离子水、78%、95%乙醇清洗沉淀1 次，得到沙棘果渣不溶性膳食纤维（IDF）；同时向上清液中加入4 倍体积的95%乙醇，4 ℃下醇沉4 h，收集沉淀，用78%、95%乙醇各洗涤1 次，即得到沙棘果渣可溶性膳食纤维（SDF），将IDF 和SDF 于60 ℃下烘干至恒重。IDF 和SDF 的总和为沙棘果渣总膳食纤维（TDF）。TDF 得率按如下公式（1）计算：

1.3.2.3 单因素试验 本试验以液料比[10∶1～30∶1（mL/g）]、pH（7.0～11.0）、酶解温度（40～60 ℃）、碱性蛋白酶添加量（7%～15%）、超声功率（0～400 W）以及超声时间（10～50 min）进行单因素单验，考察各因素对TDF 得率的影响。

1.3.2.4 响应面试验 根据单因素试验结果分析，按照Box-Behnken 中心组合试验设计原理，以液料比（A）、pH 值（B）、酶解温度（C）、碱性蛋白酶添加量（D）为自变量，以TDF 得率为响应值，采用四因素三水平的响应面分析方法优化酶解条件。试验因素水平设计见表1。

表1 Box-Behnken 设计试验因素水平及编码Table 1 Four factors，levels and codes of Box-Behnken design

1.3.3 理化性质 持水力、持油力、膨胀力参考Li等[11]的方法测定；阳离子交换能力参考Qi等[12]方法测定。

1.3.4 结构特性

1.3.4.1 扫描电镜 将待扫描的IDF、SDF 及TDF样品经干燥处理后置于载物台上，表面喷金处理。通过扫描电镜观察待测样品微观形态。

1.3.4.2 傅里叶红外光谱 IDF、SDF 及TDF 样品用KBr 压片法制样后，采用红外光谱仪测定纤维中基团的种类，波数测定范围400～4 000 cm-1。

1.3.5 吸附特性

1.3.5.1 丙烯酰胺吸附能力的测定 参考Shen等[13]的方法，稍作修改。将5.0 mg 沙棘果渣膳食纤维加入到10 mL 50 μg/mL 丙烯酰胺中，调节pH值，37 ℃，120 r/min 避光振摇5 h，离心，用高效液相色谱法测定上清中丙烯酰胺。以未加入膳食纤维的丙烯酰胺为空白对照组。丙烯酰胺吸附能力按照式（2）计算。

式中：c0——对照组丙烯酰胺浓度，μmol/L；ce——吸附平衡时丙烯酰胺浓度，μmol/L；V——丙烯酰胺溶液体积，L；m——样品质量，g。

1.3.5.2 NO2-吸附能力的测定 参考Zhang等[14]测定方法。称取0.1 g 沙棘果渣膳食纤维加入到20 mL 100 μmol/L 的亚硝酸钠中，调节pH 值至2.0 或7.0，120 r/min，37 ℃恒温振荡2 h，离心，参照GB 5009.33-2016《食品安全国家标准 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》 测定上清液中NO2-含量。以未加入膳食纤维的亚硝酸钠为空白对照组。NO2-吸附能力按照式（3）计算。

式中：c0——对照组NO2-浓度，μmol/L；ce——吸附平衡时NO2-浓度，μmol/L；V——NO2-溶液体积，L；m——样品质量，g。

1.3.5.3 玉米赤霉烯酮吸附能力的测定 参考Sun等[15]的测定方法，在10 mL 棕色离心管加入4.0 mg 沙棘果渣膳食纤维，然后加入2 mL 2 μg/mL 玉米赤霉烯酮，调节pH 值至2.0 或6.8，37 ℃，180 r/min 振荡5 h，离心，用高效液相色谱法测定上清液玉米赤霉烯酮含量。以未加入膳食纤维的玉米赤霉烯酮为空白对照组。玉米赤霉烯酮吸附能力按照式（4）计算。

式中：c0——对照组玉米赤霉烯酮质量浓度，μg/L；ce——吸附平衡时玉米赤霉烯酮质量浓度，μg/L；V——玉米赤霉烯酮溶液体积，L；m——样品质量，g。

1.3.5.4 脱氧雪腐镰刀菌烯醇吸附能力的测定参考Zhang等[16]的测定方法，稍作修改。称取4.0 mg 沙棘果渣膳食纤维于10 mL 棕色离心管中，加入2 mL 10 μg/mL 脱氧雪腐镰刀菌烯醇，调节pH值至2.0 或6.8，180 r/min，37 ℃振荡5 h，用高效液相色谱仪测定上清液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量。以未加入膳食纤维的脱氧雪腐镰刀菌烯醇为空白对照组。脱氧雪腐镰刀菌烯醇吸附能力按照式（5）计算。

脱氧雪腐镰刀菌烯醇吸附能力（μmol/g）

式中：c0——对照组脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度，μmol/L；ce——吸附平衡时脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度，μmol/L；V——脱氧雪腐镰刀菌烯醇溶液体积，L；m——样品质量，g。

1.4 数据分析

所有测定均重复3 次，结果用平均数±方差（x±s）表示。采用Statistix 8.1 和Origin 2019 对数据进行分析处理，P<0.05 为差异显著。

2 结果

2.1 沙棘果渣基本成分分析

由表2 可知，沙棘果渣基本成分中含量最多的是总膳食纤维，质量分数占比47.16%，可用作提取膳食纤维的原料。此外，沙棘果渣中蛋白质、脂肪含量较多，需要进行脱脂和除蛋白处理，增加沙棘果渣膳食纤维纯度。

表2 沙棘果渣基本成分质量分数（%）Table 2 Mass fraction of basic components of sea-buckthorn pomace（%）

2.2 沙棘果渣膳食纤维提取条件的优化

2.2.1 单因素实验

2.2.1.1 液料比对TDF 得率的影响 如图1 所示，随着液料比的增加，TDF 得率呈下降趋势，这是因为沙棘果渣中TDF 含量有限，当TDF 在水中达到平衡后，随料液比增加，可能使其水解，从而使TDF 得率降低[17]。液料比过高，后续提取需要大量乙醇增加生产成本，因此选定液料比10∶1，15∶1、20∶1 进行后续试验。

图1 不同液料比对TDF 得率的影响Fig.1 Effect of different solid-liquid ratio on the yield of TDF

2.2.1.2 pH 值对TDF 得率的影响 如图2 所示，在pH 7.0～11.0 范围内，TDF 得率先随着pH 值的增大而逐渐增加；至pH 9.0 时，TDF 得率达到最大值；随着pH 值的继续增大，TDF 得率开始降低。分析可能是pH 9.0 最接近碱性蛋白酶的最适pH 值。因此，选定pH 8.0、pH 9.0、pH 10.0 进行后续试验。

图2 不同pH 值对TDF 得率的影响Fig.2 Effect of different pH on the yield of TDF

2.2.1.3 酶解温度对TDF 得率的影响 如图3 所示，在40～60 ℃范围内，TDF 得率随着温度增加，先增加后降低。45 ℃时，TDF 得率最高，此时为酶的最适温度；当温度继续升高时，蛋白酶活性降低，使TDF 得率下降。因此在后续试验中选定40，45，50 ℃。

图3 不同酶解温度对TDF 得率的影响Fig.3 Effect of different temperature on the yield of TDF

2.2.1.4 碱性蛋白酶添加量对TDF 得率的影响如图4 所示，在7%～15%范围，TDF 得率随着酶添加量增加，呈现先增加后降低的趋势。这是因为酶添加量的不断增多，导致更多的蛋白质被酶解，进而释放出更多的TDF；而当蛋白酶对样品已经达到饱和后，仍继续增加酶添加量时，会导致TDF得率有所降低[18]。因此选定酶添加量9%，11%，13%进行后续试验。

图4 不同酶添加量对TDF 得率的影响Fig.4 Effect of different enzyme additions on the yield of TDF

2.2.1.5 超声功率对TDF 得率的影响 如图5 所示，超声辅助法的TDF 得率显著高于无超声辅助时的TDF 得率（P<0.05）。在240～400 W 范围内，TDF 得率随着功率增加，呈现先增长后降低趋势，但各组之间差异不显著（P>0.05），因此后续未将超声功率进一步优化，选定280 W 为后续试验的最优功率。

2.2.1.6 超声时间对TDF 得率的影响 如图6 所示，随着超声时间的延长，TDF 得率呈先增加后降低趋势，各组之间差异不显著（P>0.05）。后续试验对超声时间未作为进一步优化。在40 min 时TDF得率最高，因此超声时间选定为40 min。

图6 不同超声时间对TDF 得率的影响Fig.6 Effect of different ultrasonic time on the yield of TDF

2.2.2 响应面法优化

2.2.2.1 响应面优化结果 采用Design-Expert.8.0.6 统计软件，对沙棘果渣膳食纤维提取进行Box-Behnken 设计，试验结果见表3。

表3 响应面分析结果Table 3 The results of response surface analysis

将表3 数据用Design-Expert 8.0.6 软件进行拟合，得到如下回归方程：

Y=58.93-2.17A-0.32B+0.086C+0.54D-0.55AB-0.66AC+0.50AD+0.68BC-0.77BD+0.82CD-0.46A2-1.22B2-0.92C2-0.93D2。该方程二次项系数均为负，说明该方程存在最大值。

2.2.2.2 回归模型建立与讨论 回归模型方差分析见表4，整体模型极显著（P<0.001），且失拟项P＞0.05，R2=0.9602，表明模型拟合程度好。变异系数C.V%=0.89＜10，RAdj2为0.9204，说明试验可靠性强、准确度高，TDF 得率可以用该模型进行分析和预测。模型一次项A、D，二次项B2、C2、D2及交互项BD、CD 对TDF 得率影响差异极显著（P<0.05，P<0.01）；一次项B，二次项A2及交互项AB、AC、BC 对TDF 得率影响差异显著（0.01

表4 响应面试验方差分析Table 4 Variance analysis of response surface method

2.2.2.3 响应面分析 各交互项对TDF 得率的影响结果如图7 所示，从3D 模型图来看，随着酶添加量、pH 值、酶解温度的增加，TDF 得率先增加后减小，这与单因素结果一致。等高线的疏密程度和形状可以反映各因素之间的相互作用[19]。AB 等高线为椭圆形，说明液料比和pH 值交互作用显著；从AC 等高线图可知，液料比对TDF 得率的影响大于温度；BD、CD 等高线图分析可知，酶添加量对TDF 得率的影响大于温度和pH 值；BC 等高线沿着pH 值方向相对密集，说明pH 值对TDF 得率影响更大。

图7 交互作用的响应面图Fig.7 Response surface plots

2.2.2.4 确定最优条件及验证试验 通过模型分析，确定最优工艺条件为：液料比10 ∶1（mL/g），pH 9.19，温度47.77 ℃，碱性蛋白酶添加量11.38%。此条件下TDF 得率为60.87%。为了验证模型分析的准确性，综合单因素结果，选取料液比10 ∶1（mL/g），pH 9.2，温度48 ℃，碱性蛋白酶添加量11.40%，超声功率280 W，超声时间40 min，进行验证试验，重复3 次，所得沙棘果渣TDF 得率为（60.74±0.33）%，与理论预测值相近，该模型具有重现性、可行性。

2.3 理化性质测定结果

持水性、持油性和膨胀性是衡量膳食纤维生理功能的重要因素。由表5 可知，沙棘果渣IDF 的持水性和持油性优于IDF 和TDF，有研究表明这与颗粒和比表面积大小有关[20]；SDF 的膨胀性显著优于IDF 和TDF（P<0.05），原因可能是SDF 和水形成了凝胶态[21]；3 种膳食纤维阳离子交换能力大小依次为：SDF>TDF>IDF，分析原因可能与SDF粒径小，可暴露更多的活性基团有关[22]。

表5 沙棘果渣膳食纤维理化性质Table 5 Physicochemical properties of dietary fibers from sea-buckthorn pomace

2.4 结构分析

2.4.1 扫描电镜 如图8 所示，SDF、IDF、TDF 结构差异较大，SDF 的粒径较小、质地紧密、表面附着较多的颗粒；IDF 表面具有明显的片层结构，表面褶皱较多，同时具有一定量的孔洞；TDF 块状较大，形状不规则，表面褶皱较多，结构相对蓬松，同时有小团块出现。

图8 沙棘果渣膳食纤维微观结构Fig.8 The micro-structure of dietary fibers from sea-buckthorn pomace

2.4.2 傅里叶红外光谱分析 3 种膳食纤维的红外光谱均具有多种典型的多糖特征吸收峰（图9），符合膳食纤维的红外基本结构。在3 436 cm-1和2 930 cm-1附近出现的吸收峰是纤维素、半纤维素分子间或分子内-OH 和甲基或亚甲基上C-H的收缩振动所致，SDF 在波数3 436 cm-1处吸收谱带相对较宽，说明SDF 分子间氢键相互作用较强[23]。1 739 cm-1和1 614 cm-1左右的吸收峰是半纤维素C=O 收缩振动产生，说明样品中存在半乳糖醛酸[24]；1 244 cm-1处的尖峰是木质素强组分的特征性弯曲或拉伸导致的；1 017 cm-1附近的吸收峰是纤维素和半纤维素的醚键C-O-C 和C-O-H中的O-H 变形振动峰所致[25]；617 cm-1处是糖分子中β 型C-H 直立键的变角振动产生的[26]。

图9 沙棘果渣膳食纤维红外光谱图Fig.9 The infrared spectrum of dietary fibers from sea-buckthorn pomace

2.5 膳食纤维吸附能力

丙烯酰胺、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、NO2-及玉米赤霉烯酮均为食源性污染物，具有潜在的健康危害。而利用吸附剂进行体内吸附，可有效抑制危害物的吸收，减缓其体内毒性。本试验结果表明，沙棘果渣膳食纤维对以上4 种危害物均具有一定的吸附能力。

由表6 可知，pH 2.0（胃环境）时膳食纤维对丙烯酰胺、脱氧雪腐镰刀菌烯醇和NO2-的吸附能力显著高于pH 7.0（肠环境），这与阮传英等[27]、Horke等[28]和王志宏等[29]研究结果一致，说明膳食纤维对这3 种危害物的吸附主要发生在胃部。分析原因可能是酸性环境有利于膳食纤维吸附这3种危害物[30]。但膳食纤维对玉米赤霉烯酮在肠环境的吸附优于胃环境，这可能是由于中性环境对玉米赤霉烯酮具有一定的破坏作用[31]。

表6 沙棘果渣膳食纤维吸附性能力Table 6 Adsorption capacity of dietary fibers from sea-buckthorn pomace

在相同pH 值情况下，不同种类膳食纤维对4种毒素的吸附能力也有明显差异。其中，IDF 对丙烯酰胺和玉米赤霉烯酮的吸附能力显著优于SDF（P<0.05），这可能与IDF 的片层结构有关[32]；而SDF 对NO2-和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的吸附能力显著优于IDF（P<0.05），可能是因为SDF 的粒径小，增加了分子间的吸引力所致[33]。

3 结论

本研究优化超声辅助酶解法提取沙棘果渣膳食纤维的最佳工艺条件是：液料比10∶1（mL/g）、pH 9.2、温度48 ℃、蛋白酶添加量11.40%、超声功率280 W、超声时间40 min。此条件下TDF 得率为60.74%。3 种膳食纤维（TDF、IDF 和SDF）具有相似的糖类红外特征吸收峰，而在微观结构、理化性质和功能性质方面存在一定差异。SDF 粒径较小、质地紧密、表面附着较多的颗粒，有更好的膨胀性、阳离子交换能力和对NO2-、脱氧雪腐镰刀菌烯醇的吸附能力；IDF 具有明显的片层结构，表面褶皱较多，表现出更好的持水性、持油性和对丙烯酰胺和玉米赤霉烯酮的吸附能力；TDF 块状较大，形状不规则，表面褶皱较多，结构相对蓬松，同时有小团块形成，由于IDF 是TDF 的主要成分，因此TDF 具有和IDF 相似的理化性质和功能性质。该研究结果可为沙棘果渣废弃资源综合利用和沙棘果渣膳食纤维功能研究提供理论依据。