ATP5B在结直肠癌组织中的表达及意义

林 英,李时孟,岳斯琦,杨 琦*

(1.北京中医药大学东直门医院 检验科,北京100700;2.吉林大学中日联谊医院 检验科,吉林 长春130033)

结直肠癌是全球第三大癌症死因,每年有超过185万病例被发现,85万人死亡[1]。结直肠癌初期起病隐匿,发展缓慢,多数病例是在癌症晚期才被确诊,有效的诊断及发病机制的研究对肿瘤的预后有重要意义[2]。本研究通过二维色谱质谱联用技术、免疫印迹实验、免疫组化实验来探究ATP5B蛋白在结直肠癌组织与癌旁组织的表达及意义,为结直肠癌的临床诊断及发病机制的研究提供新的方向。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选用2021年4月至2022年10月在吉林大学中日联谊医院初次就诊且未经处理的结直肠癌患者组织及其配对的癌旁正常组织,癌组织选取癌灶中心区域,癌旁组织来自于距离癌组织7 cm以上的正常黏膜。共计41例。完成采集后用冷的PBS进行冲洗,液氮速冻,保存至-80°冰箱,本研究通过吉林大学中日联谊医院伦理委员会审批(20220126004)。

1.2 仪器与试剂

EASY-nLC 1200高效液相色谱仪购自美国Agilent公司,LTQXL离子阱质谱仪购自美国Thermo Fisher Scientific公司,电泳仪,ATP5B单抗购自美国Affinity公司,兔抗人ATPB5多克隆抗体购自英国Abcum公司、HRP-羊抗兔 IgG购自美国CST公司,β-actin多抗、BCA蛋白质定量试剂盒购自sab公司,DNA酶,RNA酶购自美国西格玛公司。组化试剂盒DAB显色剂购自中国Servicebio公司。无水乙醇、二甲苯购自致远化学试剂有限公司。

1.3 方法

1.3.1蛋白提取及样品制备 将样品从-80°冰箱中取出并倒入预冷的研钵中将其研磨为粉末状,用刮勺将粉末转移至加入适量蛋白裂解液的ep管中。充分混匀后冰上静置30 min。在ep管中加入适量的DNA酶和RNA酶后放入4°离心机(12 000 rpm)离心10 min。根据BCA试剂盒中步骤测定蛋白样品的浓度,将样品板放入酶标仪中,记录各个样品在OD562条件下的OD值并绘制蛋白质浓度标准曲线,在ep管中加入1/4原体积的上样缓冲液,95°条件下煮沸5 min,室温静置15 min后放入-80°冰箱中待用。

1.3.2二维质谱色谱联用技术鉴定蛋白多肽 0.1%的甲酸蛋白加入样品使其充分溶解,取50 μg样品进行上样,通过强阳离子柱和反向柱对样品进行洗脱。经LTQXL离子阱质谱仪分析检测,获取全扫描及二级扫描处理后的质谱数据图。

1.3.3免疫印迹试验 SDS-PAGE电泳,将促凝剂冷却至室温后按照比例加入到分离胶中充分混匀,1.0 mm玻璃板中加入4.5 ml的混合溶液,迅速加入适量超纯水后静置45 min,倒弃超板内超纯水。用滤纸吸去板内多余液体,加入配制好的浓缩胶后垂直插入电泳梳,静置50 min。样品经10%分离胶、5%浓缩胶将蛋白按照不同的分子量大小进行转印。用快速封闭液浸润PVDF膜10 min,倒入一抗低温孵育过夜,PBS-T洗膜3次,每次10 min,加入二抗(1∶8 000)低温孵育1 h。PBS-T洗膜5次,每次10 min,通过ECL发光法暗室显影。

1.3.4免疫组化试验 将组织样本烤片后脱蜡水化,将切片放入枸橼酸盐抗原修复缓冲液中煮沸3 min,待其冷却至室温后拿出切片用PBS溶液清洗3次,用滤纸吸去残留液体后放入湿盒内。确定组织边缘后画圈,在圈内滴加3%BSA室温封闭30 min,加入ATP5B一抗稀释液(1∶500)后低温孵育过夜。PBS洗片3次,每次5 min,滴加二抗室温孵育50 min,PBS洗片5次,每次3 min,甩干后滴加DAB显色剂并控制反应时间,超纯水冲洗切片后用苏木素复染2 min,用盐酸乙醇洗涤切片5次后放入PBS缓冲溶液中。脱水封片后由两名病理科医生在显微镜下进行图像采集与分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 二维色谱与质谱联用技术分析结果

本实验癌组织及癌旁组织中以图谱数为依据判断同一蛋白的丰度,当两个样品中蛋白图谱数比值 ≥1且蛋白图谱数差值 ≥72 时,在筛选时将其判定为差异蛋白。在此标准下检测到NUP107、CUL48、FCG、E5RH53、ENO1、TOMM40、RPS14、FGB共8个上调蛋白,CNN1、DESM、VCL、A1AT、SYNM、KCRB、MYH14、ATP5B等8个下调蛋白。ATP5B作为其中1个下调蛋白,质谱图结果见图1。

图1 ATP5B 质谱图结果

2.2 免疫印迹试验结果

运用Western blot方法对14对组织的ATP5B表达量进行分析,ATP5B在结直肠癌组织中表达量低于癌组织,如图2所示。

图2 ATP5B 免疫印迹结果

2.3 免疫组化试验结果

结果显示,ATP5B蛋白在癌组织中强阳性表达占17%(7/41),中等阳性表达占22%(9/41),弱阳性表达占61%(25/41)。在癌旁组织中,强阳性表达占22%(9/41),中等阳性表达占41%(17/41),弱阳性表达占37%(15/41)。在癌组织和癌旁组织中ATP5B的阳性率差异具有统计学意义(P<0.05),见图3。

图3 ATP5B 免疫组化结果

3 讨论

癌症的发展通常伴有能量代谢方式的变化,为癌细胞提供代谢能量并合成代谢前体产物是结直肠癌发生发展的主要表现之一[3]。线粒体是细胞能量代谢的核心细胞器,ATP合酶是调节其生物学功能的关键酶复合物之一[4]。ATP合成酶由两个相连的多亚基复合物组成,其催化部分由5个不同的亚基组成:3个α亚基,3个β亚基,γ、δ 和ε亚基各1个,其功能主要是在氧化磷酸化的过程中以α亚基和β亚基高度协调的构象变化为表现催化ATP合成或水解[5]。ATP5B基因主要编码与线粒体能量代谢核心相关的F1β亚基[6]。近年来,陆续有研究发现ATP5B与乳腺癌[7]、胶质母细胞瘤[8]、急性粒细胞白血病[9]、肾透明细胞癌[10]等恶性肿瘤的发生发展密切相关,MOTTAGHI-DASTJERDI等[11]通过生信分析推测ATP5B为胃癌发病机制的中枢基因,有研究[12]证实ATP5B在胃癌肿瘤组织中的高表达与患者的肿瘤大小、TNM分期,淋巴结转移和预后不良呈正相关,促进了肿瘤细胞的迁移、侵袭和增殖,过表达ATP5B激活FAK/AKT/MMP2通路促进了胃癌的生长,因此认为其可能对胃癌诊断有一定的辅助作用。

本研究选择通过液质联用技术(LC-MS)分析41例患者的结直肠癌及癌旁组织差异表达蛋白,得到了结直肠癌相关的差异表达蛋白质图谱,发现ATP5B是下调蛋白之一。利用免疫印迹试验和免疫组化试验对LC-MS的结果进行验证,发现在结直肠癌旁组织中ATPB1的表达量显著高于癌组织中的表达量,因此,ATP5B低表达可能与结直肠癌的发生发展存在联系,为结直肠癌的初筛和研究提供了新的靶点。ATP5B更深入的生信分析及肿瘤进展机制的研究尚不完善,需要后续实验进行更全面的探讨。