急性脑梗死病人血清miR-132和Ang-1水平变化及其与病情进展的关系

李彦岑,龙志鹏,张 毅,冯刚华

急性脑梗死(ACI)是以局部脑组织出现缺血性坏死或软化为主要特征的突发性疾病,目前临床上主要采取急性期血管再通方案,通过尽快建立侧支循环以挽救缺血半暗带(ischemic penumbra,IP)区域大量处于休眠或半休眠状态的脑细胞及神经元细胞,达到改善病人神经损伤的目的[1]。侧支循环的形成机制较为复杂,与多种血管生成因子及相关信号轴有关[2]。其中血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)是目前已知的由内皮细胞分泌、维持正常血管内皮功能并参与血管重塑过程必不可少的一种调节因子[3],在缺血性脑卒中的发生、进展及预后过程中都扮演着重要角色[4]。但是血清Ang-1易受年龄、激素分泌、基础性疾病等客观因素的影响,作为急性脑梗死诊断和病情判断指标尚存在一定的局限性。miRNAs是真核生物细胞中普遍存在的一类具有保守序列和稳定性结构的非编码单链RNA分子,参与细胞增殖、分化、凋亡、血管生成等过程。有研究发现,上调微小RNA(miR)-132表达可改善大鼠模型脑组织缺血性损伤,其机制可能与促进Ang-1/Tie2表达进而促进缺血脑组织血管再生有关[5]。本研究拟观察血清miR-132和Ang-1在急性脑梗死病人中表达水平的变化,探讨二者与急性脑梗死疾病发生风险及疾病进展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月—2020年1月在我院进行治疗的105例急性脑梗死病人作为急性脑梗死组,其中合并高血压48例,糖尿病32例,血脂异常50例,缺血性心脏病23例。纳入标准:1)符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》[6],经过头颅CT/磁共振成像(MRI)证实,按照TOAST法进行分型;2)发病时间<72 h;3)入组前未接受相关治疗。排除标准:1)合并恶性肿瘤、心肌梗死、严重感染性疾病、肺源性心脏病者;2)既往有短暂脑缺血发作、脑梗死、脑外伤或神经功能缺损者。同时选取同期在本院进行体检的健康志愿者90人作为对照组。急性脑梗死组中男72例,女33例;年龄37～75(53.18±12.21)岁。对照组中男56人,女34人;年龄40～68(50.75±11.03)岁。本研究经过本地医学伦理委员会同意,并且获得病人或家属自愿签署的知情同意书。

1.2 分组方案

1.2.1 根据梗死面积分组

105例急性脑梗死病人依据梗死面积分组,≤1.5 cm2为小面积梗死亚组(55例),>1.5～3.0 cm2且累及1个解剖部位的小血管供血区为中面积梗死亚组(31例),>3.0 cm2且累及≥2个解剖部位的大血管供血区为大面积梗死亚组(19例)。

1.2.2 根据神经功能缺损程度分组

依据美国国立卫生研究院神经功能缺损评分(National Institute Health Stroke Scale,NIHSS)[7]评定,≤15分为轻度亚组(43例),>15～30分为中度亚组(47例),>30分为重度亚组(15例)。

1.3 血清样本收集

采集急性脑梗死组及对照组受试者的空腹肘静脉血5 mL,以转速3 000 r/min离心15 min后,收集上层清液,置于-80 ℃冰箱中保存待测。

1.4 实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测血清miR-132的表达水平

采用赛默飞世尔科技(中国)有限公司的miRNA Vana PA RIS试剂盒,按照说明书提取血清总RNA。采用赛默飞世尔科技(中国)有限公司的TaqMan miRNA试剂盒,对提取得到的总RNA进行逆转录反应,得到cDNA。通过实时荧光定量PCR技术(miScript SYBR®Green PCR kit,德国QIAGEN公司)检测miR-132的表达水平,内参选择小分子U6。通过2-△△Ct法测定miR-132的RNA相对表达量。

1.5 Ang-1表达水平检测

采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清Ang-1的表达水平。人Ang-1试剂盒均购于美国R&D 公司,操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 统计学处理

2 结 果

2.1 两组临床资料比较

急性脑梗死组与对照组受试者年龄、性别、体质指数(BMI)、吸烟史、冠心病史比较,差异无统计学意义(P>0.05),急性脑梗死组中饮酒史、高血压和糖尿病均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 两组观察对象临床资料比较

2.2 两组血清miR-132和Ang-1表达水平比较

与对照组比较,急性脑梗死组病人血清miR-132[(0.77±0.39)与(1.00±0.38)]和Ang-1[(1.11±0.35)ng/mL与(1.41±0.40)ng/mL]表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 多因素Logistic回归分析急性脑梗死发病的危险因素

以发生急性脑梗死作为因变量,将单因素分析存在统计学意义的变量纳入回归方程,经多因素Logistic回归分析,高血压病史和血清miR-132和Ang-1水平降低是急性脑梗死发病的危险因素(P<0.05)。详见表2。

表2 多因素Logistic回归分析急性脑梗死发病的危险因素

2.4 急性脑梗死病人血清miR-132和Ang-1表达水平的关系

经Pearson相关性分析,急性脑梗死组病人血清miR-132和Ang-1表达水平呈正相关性(r=0.488,P<0.001)。详见图1。

图1 血清miR-132和Ang-1表达水平的相关性

2.5 急性脑梗死病人血清miR-132和Ang-1表达水平与疾病进展的关系

随着脑组织梗死面积增加,急性脑梗死病人血清miR-132和Ang-1水平则逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.05)。随着神经功能缺损程度加重,急性脑梗死病人血清miR-132和Ang-1水平则逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.05)。详见图2。

图2 血清miR-132和Ang-1表达水平与脑梗死面积和神经功能缺损程度的关系

2.6 血清miR-132和Ang-1表达水平对急性脑梗死的诊断价值

经ROC曲线分析显示,miR-132和Ang-1对急性脑梗死病人与健康人群具有一定的区分能力。miR-132作为诊断急性脑梗死病人生物标志物的曲线下面积(AUC)为0.835[95%CI(0.762,0.910),P<0.05],敏感度为78.67%,特异度为73.64%;Ang-1作为诊断急性脑梗死病人生物标志物的AUC为0.716[95%CI(0.616,0.735),P<0.05],敏感度为68.50%,特异度为59.60%。详见图3。

3 讨 论

急性脑梗死属于局部脑组织缺血性疾病,发病率、致死率和致残率均较高,尤其是对于合并高血压、糖尿病等基础性疾病病人,急性脑梗死发病风险均高于健康人群[8]。本研究对纳入的105例急性脑梗死病人疾病危险因素进行初步评估,发现急性脑梗死组中饮酒史比例、高血压病人比例和糖尿病病人比例均高于对照组,尤其是高血压是急性脑梗死疾病发生的独立危险因素。除此以外,血栓的形成、栓子脱落、血管壁斑块形成、颈动脉狭窄等都与急性脑梗死的发生密切相关[9]。急性脑梗死发病机制复杂,深入阐述急性脑梗死发病机制对于早期诊断、临床治疗和预后评估都有重大意义。

Astrup等[10]提出了“缺血半暗带”理论,为日后急性脑梗死的临床治疗提供了理论基础。由于缺血半暗带区域存在大量待激活状态的神经元细胞,通过促进侧支循环,改善局部病灶组织血流灌注,进而达到改善病人预后的目的。近几年,逐渐有学者提出了“神经血管单元”的概念,由神经元、胶质细胞、血管内皮细胞、脑细胞外基质等组成,通过信号转导、偶联机制等共同参与神经血管重塑[11]。同时多种细胞因子和miRNAs在其中也发挥着重要作用。血管生成素是一族分泌型的促血管生成因子,主要由血管平滑肌细胞、成纤维细胞、周细胞等血管内皮细胞周围的支持细胞所分泌,可促使内皮细胞与细胞外基质、内皮细胞间连接,在维持新生血管正常功能与结构的同时,还可以重塑血管,增加分支,增大管径,促使其成熟[12]。韦俊杰等[13]通过动物实验证实,Ang-1在急性脑梗死发病早期呈降低趋势,缺血后3 d开始升高,持续时间约2周,该结果表明Ang-1主要参与急性脑梗死的中晚期血管生成。闫薪如等[14]研究表明,Ang-1的表达水平与病情严重程度以及90 d预后密切相关。近年来,研究显示Ang-1可以通过多种途径改善脑血流灌注,拯救缺血半暗带神经元,恢复脑缺血后神经功能[15]。在本研究中,急性脑梗死组病人血清Ang-1水平低于对照组,并且随着脑梗死面积的增加和神经功能缺损程度的加重,急性脑梗死病人血清Ang-1表达水平逐渐降低。说明Ang-1在急性脑梗死发病初期以及疾病进展过程中都发挥着重要作用,可以作为急性脑梗死早期诊断的参考指标之一。miRNA表达水平失调与急性脑梗死的发生、发展也密切相关,由于多数miRNA位于信号转导通路的上游,且具有稳定的保守序列,组织表达特异性高,因此,有望成为多种疾病的早期诊断指标和治疗靶点。其中miR-132位于人第17号染色体,属于内皮细胞特异性miRNA,可诱导血管新生。陈澎等[5]研究表明,上调miR-132表达可以通过激活 Ang-1/Tie2信号轴促进血管新生,从而改善脑缺血大鼠脑组织缺血性损伤。在本研究中急性脑梗死组病人血清miR-132水平低于对照组,随着脑梗死面积的增加和神经功能缺损程度的加重,急性脑梗死病人血清miR-132表达水平逐渐降低。推测可能是由于急性脑梗死病人出现急性局灶性脑组织缺血后,miR-132表达量降低可能是抑制Ang-1分泌或生物活性的重要原因。说明miR-132与急性脑梗死病情进展也密切相关。经ROC曲线分析,miR-132和Ang-1都有望成为急性脑梗死诊断的早期生物标志物。但是尚需要进一步扩大样本量,并对其作用机制进行深入研究。

综上所述,急性脑梗死病人血清miR-132和Ang-1表达水平均降低,且随着脑梗死面积的增加和神经功能缺损程度的加重,两者表达水平逐渐下降,本研究可为选取有望成为急性脑梗死早期辅助诊断指标提供依据,以期为靶向治疗药物的开发及临床应用奠定基础。