肾透明细胞癌患者尿液细胞外囊泡中miR-126-5p及miR-150-5p水平联合检测的价值*

张钰,陈阳,朱芸华,张楠,王成,汪俊军

(南京大学医学院附属金陵医院＆东部战区总医院检验科,南京 210002)

肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是肾细胞癌最常见的病理亚型,尚无高灵敏度和特异性血清学标志物,早期症状隐匿,约20%～30%的患者在诊断时已发生转移,导致预后较差[1],因此,寻找高价值的ccRCC早期诊断标志物具有重要意义。细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由细胞主动分泌的介导细胞间通讯作用的脂质膜结构成分,既往研究已证实,肿瘤细胞分泌的EVs携带自身信息的miRNA等物质,可反映细胞及机体实时病理状态,极具早期分子标志物潜能[2-3]。另有研究显示,miR-126-5p和miR-150-5p与血管生成密切相关[4-5],在肿瘤发生、侵袭、转移等过程中发挥重要作用,但ccRCC 患者尿液EVs中二者水平变化及联合检测价值未见报道。本研究拟通过检测和分析ccRCC患者尿液EVs中miR-126-5p和miR-150-5p水平变化,评估其作为早期ccRCC患者辅助诊断分子标志物的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2022年5月至2023年2月于南京大学医学院附属金陵医院(东部战区总医院)泌尿外科初诊且经病理活检确诊为ccRCC的患者尿液标本48例,男性40例,女性8例,年龄(53.6±1.6)岁。所有标本均在手术或药物治疗前采集。排除标准:(1)ccRCC伴有急性感染、乙肝、结核或其他器官肿瘤患者;(2)其他肾脏良性及恶性肿瘤,如血管平滑肌脂肪瘤、嗜铬细胞瘤、肾嫌色细胞癌、乳头状肾细胞癌等;(3)接受过手术或药物干预的ccRCC患者。所有患者均根据第八版美国癌症联合会(American joint committee on cancer, AJCC) TNM分期标准[6]进行评估。同期收集本院体检中心48例年龄、性别匹配的体检健康者[男性39例,女性9例,年龄(53.4±1.1)岁]的尿液标本作为健康人对照,其肝肾功能正常,排除恶性肿瘤、炎症性循环系统疾病或其他可能影响尿液性质的疾病。本研究经东部战区总医院医学伦理委员会批准(No.2017NZGKJ-068),各研究对象均知情同意。

1.2主要试剂与仪器 细胞外囊泡提取试剂盒 ExoQuick-TCTMExosome(美国SBI公司),Trizol试剂(美国 Life Technologies 公司),氯仿、异丙醇、无水乙醇(上海国药集团试剂公司),DEPC水(上海碧云天生物技术有限公司),人工合成miR-126-5p及miR-150-5p成熟体(广州锐博生物技术有限公司),TaqMan探针(美国Applied Biosystems公司),qRT-PCR体系所用试剂(大连TaKaRa公司)。5418型高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司),Nanodrop 2000超微量分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司),高速低温组织研磨仪(武汉赛维尔生物科技有限公司),TL988-Ⅳ 96实时荧光定量PCR仪(西安天隆科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1尿液EVs分离 收集ccRCC患者及健康人对照的晨尿样本后立即于室温3 000×g离心10 min,去除沉淀物和细胞碎片,取1～2 mL上清并置于-80 ℃保存;按照ExoQuick-TCTMExosome试剂盒说明书从500 μL尿液中分离EVs,并重悬于50 μL DEPC水中。

1.3.2EVs RNA样本提取 按照本课题组前期建立的方法[7],采用Trizol试剂从EVs重悬液中提取RNA,以20 μL DEPC水溶解所得产物,样本置于-80 ℃待用。

1.3.3qRT-PCR检测EVs miRNA水平 运用基于TaqMan探针的qRT-PCR法检测尿液EVs中miR-126-5p和miR-150-5p的表达水平。miRNA逆转录PCR、qRT-PCR反应体系和PCR参数设置参照本课题组前期研究[7]。以不含RNA模板的ddH2O为阴性对照,每份样本Ct值为3次复孔的均值。采用梯度稀释的人工合成miRNA成熟体,与待测样本反应体系一致并同步进行,以标准miRNA浓度的对数值为纵坐标,测得的Ct值为横坐标绘制标准曲线,根据各样本所得Ct值对miR-126-5p和miR-150-5p进行绝对定量。

1.3.4miRNA靶基因及功能预测 miRNA靶基因预测采用在线数据库TargetScan8.0(https://www.targetscan.org/vert_80/),miRDB(https://mirdb.org/)和miRwalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)进行,取三者交集为预测靶基因;进一步利用DAVID 数据库(https://david.ncifcrf.gov)进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,以预测靶基因的潜在生物学功能和调控通路。

2 结果

2.1ccRCC患者及健康人对照肾功能指标及尿液EVs miR-126-5p和miR-150-5p水平 ccRCC患者和健康人对照肾功能指标差异无统计学意义(P>0.05),ccRCC患者尿液EVs miR-126-5p和miR-150-5p含量明显高于健康人对照组,差异有统计学意义(P=0.001 2,P<0.000 1)。与健康人对照相比,临床Ⅰ期ccRCC患者的尿液EVs miR-126-5p和miR-150-5p水平亦显著升高(P=0.000 2,P=0.000 1)。见表1。

表1 ccRCC患者及健康人对照肾功能指标及尿液EVs miR-126-5p和miR-150-5p表达水平

2.2ROC曲线分析尿液EVs筛查ccRCC的价值 miR-126-5p区分健康人对照和ccRCC的AUCROC为0.690(95%CI:0.585～0.794),区分Ⅰ期ccRCC的AUCROC为0.734(95%CI:0.630～0.839);尿液EVs miR-150-5p用于区分ccRCC的AUCROC为0.787(95%CI:0.692～0.881),区分Ⅰ期ccRCC的AUCROC为0.736(95%CI:0.602～0.870)。两种miRNA组合区分ccRCC的AUCROC为0.815(95%CI:0.724～0.905),区分Ⅰ期ccRCC的AUCROC为0.855(95%CI:0.776～0.946)。见图1。

注:A,尿液EVs miRNA筛查ccRCC价值;B,尿液EVs miRNA筛查临床Ⅰ期ccRCC价值。

2.3ccRCC患者尿液EVs miR-126-5p和miR-150-5p与临床肾功能指标的相关性结果 尿液EVs miR-126-5p及miR-150-5p含量与血清肌酐水平呈显著负相关(r=-0.476,P=0.001;r=-0.345,P=0.016),而与尿素和尿酸水平的相关性差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 ccRCC患者尿液EVs miR-126-5p和miR-150-5p与临床肾功能指标的相关性

2.4生物信息学分析 联合运用TargetScan 8.0,miRDB和miRwalk在线数据库,取三者预测靶基因的交集得到miR-126-5p和miR-150-5p的靶基因分别有146和49种;进一步用DAVID(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery)数据库通路富集分析结果显示,miR-126-5p主要调控轴突引导,而miR-150-5p与多种癌症发生、发展密切相关,主要参与Wnt、磷脂酰肌醇三激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)等信号通路的调节。见图2。

注:A,miR-126-5p靶基因预测与KEGG通路;B,miR-150-5p靶基因预测与KEGG通路。

3 讨论

EVs miRNA具备作为ccRCC的新型分子标志物潜能[2],可为机体的病理动态变化提供更具价值的线索[8]。本研究针对ccRCC患者尿液EVs中与血管生成密切相关miR-126-5p和miR-150-5p的变化开展研究,发现ccRCC患者特别是早期(临床Ⅰ期)患者尿液EVs中miR-126-5p、miR-150-5p均上调,与ccRCC发生、发展相关。

本研究发现ccRCC患者尿液EVs中miR-126-5p与miR-150-5p水平较健康人对照显著升高。目前,尚无尿液EVs miR-126-5p变化及价值报道,相关研究主要集中于外周血。Dias等[9]发现肿瘤切除后ccRCC患者血浆EVs来源的miR-126-5p表达下调,提示EVs miR-126-5p水平升高可反映肾肿瘤发生发展,这与本研究结果一致。本研究聚焦于尿液EVs来源的miRNA,关注其早期诊断价值,发现联合检测miR-126-5p和miR-150-5p水平有望辅助筛查早期ccRCC。此外,miR-150-5p在非小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤中均存在异常表达[5]。既往研究[10]已证实miR-150-5p在RCC患者血清及肾癌细胞系来源的EVs中表达上调,且血清miR-150-5p可以辅助RCC患者的诊断(AUCROC=0.717),但其早期诊断价值及其在尿液EVs中的价值尚未见报道。本研究发现ccRCC患者尿液EVs中miR-150-5p水平升高,在病程早期已有明显趋势,筛查价值更优。

研究表明[11],miR-126-5p和miR-150-5p与肿瘤发生发展密切相关,与本研究的生信分析结果相一致。结果显示,miR-126-5p参与轴突引导通路。据报道ccRCC中轴突引导调节蛋白SEMA6A的过表达,促进了ccRCC的恶性表型[12]。本研究发现miR-150-5p参与调控Wnt、PI3K-Akt等与癌症密切相关的信号通路,在ccRCC中发挥重要作用。Gorka等[13]发现Wnt通路活性受特定miRNA表达水平影响,调节ccRCC中上皮间充质转化(EMT)进程。同时,本研究预测显示miR-150-5p靶基因为肿瘤蛋白P53(TP53),是肾嫌色细胞癌中最常见的体细胞突变基因[14],可导致舒尼替尼耐药,与患者预后相关[15],对此通路深入研究或可为ccRCC治疗耐药提供新的思路。

本研究通过ROC曲线证实尿液EVs来源的miR-126-5p及miR-150-5p单独或联合检测均具备较好的早期ccRCC诊断效能,且miR-126-5p及miR-150-5p与ccRCC患者血清肌酐水平均呈显著负相关,提示其可表征肾功能的损伤。目前,关于尿液EVs miRNA作为早期筛查肾细胞癌的标志物鲜有报道[16-17],其价值有待深入挖掘。尿液EVs miRNA具有无创便捷、易于实时监测肾脏等优点,但仍面临诸多挑战。例如EVs分离、定量的方法尚未标准化,各研究间可比性较差等。本研究采用试剂盒提取尿液EVs,方便快捷,适合单样本水平操作,对于EVs miRNA的临床转化较具优势。

本研究尚存在一定局限性:(1)样本量偏少,缺乏晚期ccRCC患者,尿液EVs miR-126-5p及miR-150-5p与临床分期的相关性尚不清楚;(2)仅收集治疗前标本,未对比治疗前后的表达水平变化;(3)EVs miR-126-5p及miR-150-5p的来源、去路、对其调控的生物学功能有待进一步研究。

综上所述,本研究发现ccRCC患者尤其是早期患者尿液EVs miR-126-5p及miR-150-5p水平显著升高,二者联合检测具备较优的早期筛查价值。同时,miR-126-5p及miR-150-5p与ccRCC的进展关系密切,对其调控机制及肿瘤生物学功能深入探究或可为ccRCC的诊治提供新的实验依据。