红芪多糖通过调控PI3K/Akt 信号通路对异丙肾上腺素所致小鼠心肌肥厚的改善作用

陈啟艳，孙 媛，高春华，孟楚浛，隋海娟，于海英，张 玲*

（1.锦州医科大学基础医学院，辽宁 锦州 121001； 2.锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121001；3.锦州医科大学药学院，辽宁 锦州 121001； 4.锦州医科大学基础医学实验教学中心，辽宁 锦州 121001）

心肌肥厚是许多心血管疾病发展过程中一个重要的病理阶段，持续性心肌肥厚最终会因心脏功能失常而出现心力衰竭，因此，探寻延缓或逆转病理性心肌肥厚的药物已成为防治心力衰竭的重要策略之一。红芪多糖是红芪的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老、免疫调节、抗炎、降血糖、抗肿瘤等多种药理作用［1-3］。在心血管疾病方面，已有研究显示红芪多糖对糖尿病心肌病小鼠和急性心肌梗死大鼠的心肌损伤具有保护作用［4-5］，但对心肌肥厚是否存在影响未见报道。本次研究运用异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO） 诱导小鼠心肌肥厚模型，探讨红芪多糖对小鼠心肌肥厚的作用及相关信号通路的影响，以期为心肌肥厚的防治提供新的用药方案。

1 材料

1.1 动物 SPF 级野生雄性C57BL/6N 小鼠，体质量20～24 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司 ［实验动物生产许可证号SCXK （京）2021-0006］，饲养于锦州医科大学SPF 级实验动物中心［实验动物使用许可证号SYXK （辽） 2019-0007］，环境温度20～24 ℃、相对湿度50% ～56%。动物实验中的所有操作均符合锦州医科大学动物伦理委员会要求（伦理号2022029）。

1.2 试剂 红芪多糖 （ 纯度 90%，批号20210508，甘肃益生祥生物技术有限公司）。ISO、普萘洛尔 （货号 I5627-5G、BCBB9359，美国Sigma 公司）； 游离脂肪酸（FFA）、腺苷三磷酸（ATP）、腺苷单磷酸（AMP） ELISA 试剂盒（货号DY5848、DY4385-05、KGE011B，美国R＆D 公司）； 逆转录试剂盒（货号R333-01，南京诺唯赞生物科技股份有限公司）； 磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、磷酸化-PI3K （p-PI3K） 一抗 （货号ab182653、ab189401，英国Abcam 公司）； 蛋白激酶B （Akt）、磷酸化-Akt （p-Akt） 一抗 （货号4691、4060，美国Cell Signaling Technology 公司）；β-actin （货号210819，北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 仪器 CISA-1000 计算机图象分析系统（北京大恒图像视觉有限公司）； Pclab 生物信号采集处理系统（南京易美科技有限公司）； 光学显微镜及照相机 （日本Olympus 公司）； Bio-Rad Model 1000/500 型电泳仪 （ 美国 Bio-Rad 公司）；ChampGelTM3000 凝胶成像系统（北京赛智创业科技有限公司）。

2 方法

2.1 分组 50 只小鼠适应性饲养1 周后，按随机数字表法分为空白组、模型组、普萘洛尔组（40 mg/kg） 和红芪多糖低、高剂量组 （60、120 mg/kg），每组10 只。普萘洛尔组灌胃给予40 mg/kg普萘洛尔； 红芪多糖组灌胃给予60、120 mg/kg 红芪多糖； 空白组和模型组灌胃给予等量蒸馏水，每天1 次，连续15 d。模型组和各给药组均在灌胃药物1 d 后开始造模，前3 d 于小鼠背部皮下分别注射40、20、10 mg/kg ISO，第4 天皮下注射5 mg/kg ISO，持续10 d； 空白组小鼠皮下注射等量生理盐水。

2.2 小鼠心脏指数测定 给药结束后24 h，称定小鼠体质量； 取血处死后，开胸取出心脏，剪去周围血管及组织，生理盐水洗尽残血，滤纸吸干，称定心脏质量； 再剔除心房和右心室，称定左心室质量。计算全心指数（心脏质量/体质量） 和左心指数（左心室质量/体质量）。

2.3 Masson 染色观察心肌组织形态变化 左心室心肌组织块于4% 多聚甲醛中固定，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，制备组织切片，行Masson 染色，于光镜下观察，而后采用CISA-1000 计算机图象分析系统测定心肌细胞横径 （cardiomyocyte diameter，TDM） 和心肌胶原百分比 （cardiac ventricle fibrosis，CVF），每张切片随机选取3 个视野，每个视野检测10 个细胞。

2.4 ELISA 法检测心肌组织FFA、ATP、AMP 水平 取出于液氮灌中冻存的心肌组织，加入预冷的RIPA 裂解液，匀浆，收集匀浆液于离心管中，按ELISA 试剂盒说明书检测小鼠心肌组织FFA、ATP和AMP 水平。

2.5 RT-qPCR 法检测心肌组织ANP、BNPmRNA表达 取出于液氮灌中冻存的心肌组织，经裂解、抽提、RNA 沉淀和清洗，提取心肌总RNA，通过逆转录生成cDNA。通过Primer Bank 网站在线设计引物序列，由生工生物工程（上海） 股份有限公司合成，引物序列见表1。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus） 试剂盒行RT-qPCR 反应，以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCT法计算小鼠心肌组织ANP、BNPmRNA 表达。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.6 Western blot 法检测心肌组织PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表达 取100 mg 冻存的心肌组织，加入胞浆蛋白抽提试剂于匀浆器中充分匀浆，按试剂盒说明书以BCA 法检测蛋白浓度。制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE），蛋白样本经电泳分离、转膜后，封闭液封闭1 h，加入稀释的PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 和β-actin 一抗，4 ℃杂交孵育过夜，洗涤后再加二抗进行孵育，ECL 法显影，通过Image J 软件分析条带灰度值，各目的蛋白表达量以内参β-actin 进行标准化。

2.7 统计学分析 通过SPSS 21.0 软件进行处理，符合正态分布的计量资料以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，有差别者组间两两比较采用最小显著差数法（LSD 法） 检验； 偏态或方差不齐时采用秩和检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 红芪多糖对心肌肥厚小鼠心脏指数的影响由表2 可知，与空白组比较，模型组全心指数和左心指数均升高（P＜0.01），分别升高了19.75%和23.03%，说明小鼠心脏指数增大，造模成功； 与模型组比较，红芪多糖低、高剂量组和普萘洛尔组全心指数均降低（P＜0.05，P＜0.01），分别降低了5.26%、7.37% 和13.15%，左心指数均降低（P＜0.05，P＜0.01），分别降低了6.15%、9.36%和14.97%，表明红芪多糖能抑制ISO 引起的小鼠心脏指数变大。

表2 各组小鼠心脏指数比较（mg/g，±s，n＝10）Tab.2 Comparison of mouse cardiac indices levels in each group （mg/g，±s，n＝10）

表2 各组小鼠心脏指数比较（mg/g，±s，n＝10）Tab.2 Comparison of mouse cardiac indices levels in each group （mg/g，±s，n＝10）

注： 与空白组比较，**P ＜0.01； 与模型组比较，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别全心指数左心指数空白组4.76±0.283.04±0.21模型组5.70±0.32**3.74±0.24**红芪多糖低剂量组5.40±0.31＃3.51±0.23＃红芪多糖高剂量组5.28±0.26＃＃3.39±0.21＃＃普萘洛尔组4.95±0.31＃＃3.18±0.18＃＃

3.2 红芪多糖对心肌肥厚小鼠心肌组织形态及TDM、CVF 值的影响 如图1 所示，空白组小鼠心肌细胞未见明显肥大及坏死，无胶原纤维增生； 与空白组比较，模型组可见小鼠心肌细胞变大，有局灶性坏死，胶原纤维呈大斑片状增生（图中绿色部分）； 与模型组比较，红芪多糖各剂量组和普萘洛尔组小鼠心肌细胞肥大程度减轻，心肌纤维排列较整齐，偶有点片状坏死，胶原纤维增生较少，其中以普萘洛尔组小鼠心肌病变的改善程度最好，红芪多糖高剂量组次之。

图1 各组小鼠心肌组织形态变化（Masson，×200）Fig.1 Morphological changes of mouse myocardial tissue in each group （Masson，×200）

由表3 可知，与空白组比较，模型组小鼠TDM 和CVF 值升高 （P＜0.01），分别升高了29.13%和90.43%； 与模型组比较，红芪多糖低、高剂量组和普萘洛尔组小鼠TDM 值降低 （P＜0.01），分别降低了7.06%、13.97% 和19.34%，CVF 值也降低（P＜0.01），分别降低了14.1%、25.93%和74.96%。

表3 各组小鼠TDM 和CVF 值比较（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of mouse TDM and CVF values in each group （±s，n＝10）

表3 各组小鼠TDM 和CVF 值比较（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of mouse TDM and CVF values in each group （±s，n＝10）

注： 与空白组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别TDM/μmCVF/%空白组10.09±0.523.34±0.58模型组13.03±0.59**17.77±1.34**红芪多糖低剂量组12.11±0.56＃＃13.00±1.57＃＃红芪多糖高剂量组11.21±0.49＃＃7.57±0.98＃＃普萘洛尔组10.51±0.52＃＃4.45±0.87＃＃

3.3 红芪多糖对心肌肥厚小鼠心肌组织FFA、ATP、AMP 水平和ATP/AMP 比值的影响 由表4可知，与空白组比较，模型组小鼠心肌能量代谢利用底物FFA 水平升高（P＜0.01），反应心肌能量生成水平的ATP、AMP 和ATP/AMP 比值降低（P＜0.01）； 与模型组比较，红芪多糖各剂量组和普萘洛尔组小鼠心肌组织FFA 水平降低 （P＜0.01），ATP、AMP 和ATP/AMP 值升高 （P＜0.05，P＜0.01）。

表4 各组小鼠心肌组织FFA、ATP、AMP 水平和ATP/AMP 比值比较（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of FFA，ATP，AMP levels and ATP/AMP ratio in mouse myocardial tissue of each group （±s，n ＝10）

表4 各组小鼠心肌组织FFA、ATP、AMP 水平和ATP/AMP 比值比较（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of FFA，ATP，AMP levels and ATP/AMP ratio in mouse myocardial tissue of each group （±s，n ＝10）

注： 与空白组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别FFA/（nmol·L-1）ATP/（mg·g-1）AMP/（mg·g-1）ATP/AMP空白组10.09±0.520.49±0.040.74±0.030.70±0.06模型组13.03±0.59**0.21±0.03**0.48±0.05**0.45±0.06**红芪多糖低剂量组12.11±0.56＃＃0.30±0.03＃＃0.60±0.06＃＃0.50±0.05＃红芪多糖高剂量组11.21±0.49＃＃0.36±0.03＃＃0.64±0.04＃＃0.56±0.04＃＃普萘洛尔组10.51±0.52＃＃0.43±0.03＃＃0.69±0.05＃＃0.63±0.06＃＃

3.4 红芪多糖对心肌肥厚小鼠心肌组织ANP、BNPmRNA 表达的影响 在心脏处于应激状态，心室肌牵张会释放ANP 和BNP 以对抗心肌肥厚，因此ANP 和BNP 被认为是心肌肥厚的重要标志［6］。如图2 所示，与空白组比较，模型组小鼠心肌组织ANP、BNPmRNA 表达均升高（P＜0.01）；与模型组比较，红芪多糖各剂量组和普萘洛尔组小鼠心肌组织ANP、BNPmRNA 表达均降低 （P＜0.01）。

图2 各组小鼠心肌组织ANP、BNP mRNA 表达比较（±s，n＝10）Fig.2 Comparison of ANP and BNP mRNA expressions in mouse myocardial tissue of each group （±s，n＝10）

3.5 红芪多糖对心肌肥厚小鼠心肌组织PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达的影响 如图3 所示，与空白组比较，模型组小鼠心肌组织p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 蛋白表达比值均降低（P＜0.01）； 与模型组比较，红芪多糖各剂量组和普萘洛尔组小鼠心肌组织p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 蛋白表达比值均有升高（P＜0.01）。

图3 各组小鼠心肌组织PI3K 和Akt 蛋白表达比较（±s，n＝5）Fig.3 Comparison of of PI3K and Akt protein expressions in mouse myocardial tissue of each group （±s，n＝5）

4 讨论

神经体液因素是引起心肌肥厚的多种因素之一。交感神经系统过度激活，释放的儿茶酚胺可激动肾上腺素受体引起心肌肥厚。ISO 激动β 受体可引起心肌细胞肥大、胶原纤维增生，故常作为基础研究诱导心肌肥厚模型的药物［7-8］。

全心指数是心肌肥厚的重要检测指标，左心指数更是人类心肌肥厚的诊断指标［9］。心肌肥厚病理表现为心肌细胞肥大和心肌间质纤维化。心肌细胞表面积可以衡量心肌细胞肥大程度，间质纤维化则会导致心室重构进而引起心律失常、心衰和猝死等。CVF 可反映胶原的沉积程度。本实验结果显示，模型组小鼠全心指数和左心指数均较空白组增加； 心肌组织切片观察和TDM、CVF 结果也证实了模型组小鼠心肌细胞肥大和间质纤维化，说明模型制备成功。

近年来的研究发现，心肌细胞能量代谢紊乱可能是导致心肌肥厚和心肌组织重构的潜在机制［10］。ATP 作为细胞活力标志，其水平高低可衡量心肌能量储备状态。但有学者发现，当心肌细胞处于病理状态下，ATP 和AMP 水平均会发生变化［11］，因此ATP/AMP 的改变是能量变化的综合体现。本实验结果显示，ISO 可引起小鼠心肌细胞FFA 水平升高和ATP/AMP 比值降低，说明模型小鼠心肌细胞已出现能量代谢紊乱、能量供应及储备不足情况。同时，ISO 还会使作为心肌肥厚标志的ANP、BNPmRNA 表达升高，这些结果也间接反映了ISO 对心肌组织的不良影响。

本研究以“正气亏虚” 为心肌肥厚的中医病机［9］，运用红芪的“补气升阳、生津养血” 之功效［12］，观察红芪主要活性成分红芪多糖对ISO 诱导小鼠心肌肥厚模型的干预作用。结果表明，红芪多糖可降低ISO 引起全心指数、左心指数、TDM和CVF 值的升高，改善心肌组织病理性改变，降低ISO 诱导的心肌组织FFA 水平和ANP、BNPmRNA 表达，提高ATP/AMP 比值。这些结果表明红芪多糖可通过改善FFA 的氧化代谢、提高心肌组织能量供应和储备而使小鼠的心肌肥厚指标趋于正常。

已有报道指出，ISO 可通过多条信号通路诱导心肌肥厚，PI3K/Akt 信号通路便是其中重要的一条［13］。作为一种细胞内磷脂酰肌醇激酶，PI3K 可被胞外多种信号激活，其活性产物促使Akt 转移到质膜表面活化，并进一步磷酸化下游因子（多种酶、激酶和转录因子等），发挥调节细胞增殖、生长、分化、凋亡等作用［14-16］，调控心肌细胞的生存和功能，进而干预心肌肥厚［17-18］。它还是调控线粒体的通路之一，而线粒体是细胞的“能量供应器”［19-20］。本研究显示，ISO 能抑制PI3K/Akt 信号通路中PI3K 和Akt 的磷酸化，而红芪多糖可上调ISO 引发的p-PI3K/PI3K 和p-Akt/Akt 比值降低。

综上所述，本次研究证实红芪多糖对ISO 诱导小鼠心肌肥厚具有改善作用，该作用可能与提升PI3K/Akt 信号通路活性有关。