非洲猪瘟病毒p22 蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

矫健，李建达，韩先杰，张琳，张玉玉，任素芳，刘飞，陈智，Nataliia Hrabchenko，张文娟，于江，吴家强

(1. 青岛农业大学动物医学院，山东 青岛 266109；2. 山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室/农业农村部畜禽生物组学重点实验室，山东 济南 250100；3. 山东碧蓝生物科技有限公司，山东 泰安 271400)

非洲猪瘟(African swine fever， ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus， ASFV)引起的一种高度传染性、出血性疾病，临床上以高热、皮肤发绀、淋巴结及脏器广泛出血为主要特征，如肾瘀斑、皮肤红斑、肺水肿、弥散性血管内凝血等[1]。 ASFV 主要通过接触性传播，家猪和野猪都是其主要宿主，一旦侵入家猪，便可在猪群中快速传播，发病率和死亡率高达100%[2-3]，感染性病毒在组织中能够存在较长时间，尤其是淋巴结和扁桃体[4]。 此外，该病毒也是唯一已知的DNA 虫媒病毒，能够通过软蜱进行传播[5]。 ASF于1921 年首次在肯尼亚报道，随后传入其他非洲国家[6]。 2007 年，在格鲁吉亚发现了毒力更高的ASFV Ⅱ型，并迅速传播[7]。 2018 年8 月，我国沈阳首次暴发ASF，随后迅速蔓延到全国所有省份[8]，对我国乃至全世界的养猪业造成了严重的经济损失。

ASFV 是Asfarviridae 科中Asfarvirus属的唯一成员[9]，是一种有囊膜的双链DNA 病毒。 ASFV粒子是具有多层结构的二十面体，直径约为200 nm，病毒粒子结构自内向外依次为类核、核壳、内囊膜、衣壳、外囊膜[10-11]。 ASFV 基因组长度约为170～194 kb，目前已从其中鉴定出结构蛋白68种，部分蛋白的功能尚不清楚[12]。 这些结构蛋白分布在不同的区域，在病毒黏附与入侵、病毒基因组复制和转录、病毒包装与出芽以及免疫逃避等病毒感染的不同方面发挥着重要的作用[5]。 由于ASFV 结构复杂繁冗，对其功能的了解也十分有限，到目前为止还没有完全有效的ASFV 商业疫苗，因此鉴定病毒结构蛋白的免疫原性在探讨病毒与宿主相互作用中至关重要[13]。

ASFV p22 蛋白由KP177R基因编码，分子量为22 kDa。 p22 最初被描述为一种早期诱导的跨膜结构蛋白，位于病毒颗粒外部，能够从病毒颗粒表面溶解释放出来[14]。 然而，进一步的研究发现，p22 蛋白位于病毒颗粒的内膜和感染细胞的表面[15]。 目前，p22 蛋白在ASFV 感染致病过程中的作用仍不清楚。 本研究通过大肠杆菌原核表达系统成功表达并纯化出p22 重组蛋白，通过免疫Balb/c 小鼠成功制备了其单克隆抗体(MAb)，为进一步探究p22 蛋白的生物学作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、菌株、载体及实验动物

大肠杆菌Trans5α、BL21(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；骨髓瘤细胞SP2/0、pET-32a 载体均由本实验室保存；ASFV标准阳性血清购自中国兽医药品监察所；SPF 级5～8 周龄Balb/c 雌性小鼠购自济南朋悦试验动物繁育有限公司。

1.2 主要试剂

质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司；限制性核酸内切酶、T4 DNA 连接酶、蛋白Marker 均购自赛默飞世尔科技公司；Ni-NTA Agarose 购自德国Qiagen 公司；单抗亚型鉴定试剂盒购自美国Southern Biotech公司；ECL 发光液、羊抗鼠HRP-IgG、羊抗猪HRPIgG 购自Beyotime 公司。

1.3 ASFV p22 蛋白的原核表达

1.3.1 重组表达质粒pET-32a-p22 的构建 根据ASFV pig/HLJ/2018 株基因序列(GenBank No.MK333180.1)的KP177R基因序列进行引物设计，正向引物(p22-F)序列:5＇-CTCGAGTTATGCGTGTTTATGATTAC-3＇(包含XhoⅠ酶切位点)， 反向引物(p22-R) 序列: 5＇ - GGATCCAAAAAACAGCAGCCGCCGA-3＇(包含BamHⅠ酶切位点)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 以合成的密码子优化后的p22基因序列为模板，使用引物扩增目的基因片段，PCR 反应程序为95 ℃，5 min；94 ℃，45 s，58 ℃，45 s，72℃，45 s，32 个循环；72 ℃，10 min；4 ℃结束。 将扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳并纯化回收，用T4 DNA 连接酶分别将KP177R基因与pET-32a 载体连接，将连接产物转化到感受态细胞Trans5α 中。 挑取单克隆摇菌，菌液经PCR 鉴定为阳性后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。 测序成功后将阳性重组质粒命名为pET-32a-p22。

1.3.2 ASFV p22 重组蛋白的表达和纯化 将阳性重组质粒pET-32a-p22 转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆至LB 培养基中37 ℃培养过夜，取1 mL 菌液接种至氨苄青霉素(ampicillin，Amp)抗性的100 mL LB 液体培养基中，37 ℃、220 r/min 摇床培养至OD600值达到0.6～0.8 时，添加终浓度为1 mmol/L 的IPTG 诱导目的蛋白表达，诱导4 h 后，收集菌体沉淀，使用裂解液( 300 mmol/L NaCl， 50 mmol/L NaH2PO4，pH＝7.4)重悬菌体，进行超声破碎，4 ℃、4 000 r/min 离心，经SDS-PAGE 电泳鉴定后使用0.45 μm 滤膜过滤，与蛋白纯化填料4 ℃过夜结合。 采用亲和层析的方式纯化，收集洗脱产物，用于SDS-PAGE 鉴定，使用超滤管将有单一目的蛋白条带的洗脱产物浓缩并置换到PBS中，-80 ℃保存。

1.3.3 ASFV p22 重组蛋白的Western blot 鉴定重组p22 蛋白纯化后进行SDS-PAGE 电泳，随后转移到PVDF 膜上，经5%脱脂奶粉封闭后，以ASFV 标准阳性血清(1∶1 000)作为一抗孵育2 h。清洗后，加入HRP 标记的羊抗猪IgG 二抗(1∶8 000)孵育1 h，进行Western blot 鉴定。

1.4 ASFV p22 单克隆抗体的制备

1.4.1 Balb/c 小鼠的免疫及血清效价的测定纯化后的重组p22 蛋白与等体积弗氏完全佐剂乳化后，对4 只5～8 周龄Balb/c 小鼠进行背部多点皮下注射，免疫剂量为100 μg/只，每14 d 免疫一次，共免疫3 次。 最后一次免疫7 d 后从小鼠尾静脉取少量血，分离血清，通过间接ELISA 方法检测血清中的抗体效价。 将纯化的p22 重组蛋白以2 g/mL 的浓度包被到聚苯乙烯96 孔反应板(100 μL/孔)，4 ℃放置过夜；次日用PBST 洗板3次后进行封闭(l50 μL/孔封闭液)，室温放置0.5 h；用样品稀释液将小鼠血清按1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，1 ∶64 000，1∶128 000……进行倍比稀释，洗板3 次后加入稀释好的血清并设置空白血清做阴性对照(100 μL/孔)，室温孵育1 h；洗板3 次后加入HRP 标记的鼠二抗(1∶5 000，100 μL/孔)，37 ℃孵育40 min；PBST 洗板5 次并拍干，加入TMB(100 μL/孔)，室温避光显色10 ～15 min；加入终止液(50 μL/孔)，用酶标仪测定450 nm 处各孔的吸光值。

1.4.2 细胞融合及亚克隆筛选 按照标准流程取免疫后的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0 融合，通过间接ELISA 方法检测筛选阳性杂交瘤细胞，使用有限稀释法对单克隆阳性孔进行3 次亚克隆。 筛选出稳定表达p22 的阳性孔，进行扩大培养。

1.4.3 腹水制备 将阳性杂交瘤细胞扩大培养并注射至Balb/c 小鼠的腹腔(经弗氏不完全佐剂乳化)，7～10 d 后观察小鼠腹部隆起状况，并及时抽取腹水。 12 000 r/min 离心10 min，收集上清，-70 ℃冻存备用。

1.5 ASFV p22 单克隆抗体的鉴定

1.5.1 单克隆抗体效价鉴定 将进行不同比例稀释后的腹水作为一抗，HRP 标记的羊抗鼠IgG作为二抗，用重组p22 蛋白建立的间接ELISA 方法进行效价的测定(方法同1.4.1)。

1.5.2 单克隆抗体亚型鉴定 用小鼠抗体亚型鉴定试剂盒对杂交瘤细胞制备的腹水抗体进行亚型测定。 准备好包被有重组p22 蛋白的板条(50 ng/孔)，每个克隆收集600 μL 腹水上清，分别滴加到6 个对应的酶标孔中(100 μL/孔)，37 ℃孵育1 h；PBST 洗板3 次，将稀释好的分型二抗抗IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3 的抗体加入6个孔中，37 ℃孵育1 h；PBST 洗板3 次，加入TMB显色，有信号反应的孔对应的鉴定二抗亚型即为该抗体的亚型。

1.5.3 Western blot 鉴定单克隆抗体的免疫原性纯化的重组p22 蛋白经SDS-PAGE 电泳后，转移至PVDF 膜上，使用5%脱脂奶粉封闭2 h；PBST 洗膜后，加入单克隆抗体(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；清洗后，加入HRP 标记的羊抗鼠IgG 二抗孵育1 h，充分清洗后使用ECL 发光液进行曝光，观察结果。

2 结果与分析

2.1 重组表达质粒pET32a-p22 的构建

用p22-F/p22-R 引物对优化的p22基因进行扩增，结果显示，PCR 扩增后的p22基因片段约为447 bp，大小符合预期(图1)。 通过酶切酶连将p22扩增产物连接到pET-32a 质粒中。 经测序分析后，基因测序结果完全正确。

图1 p22 基因PCR 扩增目的片段

2.2 重组p22 蛋白的表达和纯化

SDS-PAGE 电泳结果显示，与未诱导组相比，诱导组可见与预期大小一致的37 kDa 融合蛋白，经超声破碎后可溶性分析发现，重组p22 蛋白条带出现在超声后上清中，表明重组p22 蛋白为可溶性表达(图2A)。 进一步大量诱导p22 重组蛋白的表达，并与His Ni-NTA Agarose 亲和层析柱结合，使用不同浓度梯度的咪唑洗脱液洗脱蛋白，收集洗脱液，随后进行SDS-PAGE 电泳鉴定。 结果显示，使用高浓度洗脱液时，在37 kDa 处出现单一条带(图2B)，纯化后纯度大于95%。

图2 重组p22 蛋白的表达(A)、纯化(B)及鉴定(C)

2.3 重组p22 蛋白的Western blot 鉴定

对重组p22 蛋白进行Western blot 鉴定，通过His 标签抗体孵育后，在37 kDa 处检测到嵌合His标签的p22 蛋白；而使用ASFV 阳性血清孵育后，发现重组p22 蛋白能够与ASFV 阳性血清发生特异性结合(图2C)，表明该抗原具有良好免疫原性。

2.4 单克隆抗体的制备及鉴定

2.4.1 血清效价的测定 三免7 d 后通过间接ELISA 方法检测接种小鼠血清效价，测得1、2、3号小鼠的血清效价为1∶128 000，4、5 号小鼠的血清效价为1∶64 000(图3A)。 选取1、2、3 号小鼠进行加强免疫。

图3 小鼠血清效价(A)及单克隆抗体效价(B)的测定

2.4.2 单克隆抗体效价测定 在骨髓瘤细胞和脾细胞融合后，进行融合筛选，对筛选的阳性孔进行3 次亚克隆后，经间接ELISA 方法检测，最终筛选到了两株能够稳定分泌重组p22 MAb 的杂交瘤细胞株，通过小鼠腹腔注射两种杂交瘤细胞株，制备了小鼠腹水，通过间接ELISA 方法测定腹水的效价分别为1∶512 000 和1∶256 000(图3B)，将获得的单克隆抗体命名为2D6 和5E7。

2.4.3 单克隆抗体亚型鉴定 采用美国Southern Biotech 公司的单抗亚型鉴定试剂盒分别对p22 MAb 2D6 和5E7 的亚型进行检测，结果显示两种MAb 的亚型均为IgG1(表1)。

表1 单克隆抗体亚型鉴定

2.4.4 单克隆抗体的免疫反应鉴定 为了鉴定MAb 2D6 和5E7 的免疫反应性，通过Western blot检测了其对外源性p22 蛋白的反应性。 结果显示，两株MAb 均能够在37 kDa 处与p22 蛋白发生特异性反应(图4)。

3 讨论与结论

自2018 年ASF 传入中国并迅速传播以来，ASF 对生猪生产造成了重大的经济威胁，目前，在中国传播的ASFV 类型主要为一种高毒力的基因型Ⅱ毒株[16]，基因型Ⅰ毒株也有报道[17]。 ASFV在环境中具有高传染性和稳定性，可通过与受感染的猪或其产品直接接触或通过软蜱进行传播[18]。 直到目前，仍然没有针对ASFV 的有效商业疫苗，使得非洲猪瘟的预防、控制和治疗变得十分艰难[19]，因此，筛选ASF 免疫原性蛋白，鉴定免疫相关基因，将有助于ASF 疫苗的开发。 另外，需要对ASFV 的结构功能等基础研究进行攻克，以期为ASF 疫苗或诊断试剂的研发提供更多理论依据。 相关研究表明，鉴定最具抗原性的病毒蛋白对改进血清学诊断试验具有重要作用，在ASFV 血清诊断试验中使用重组蛋白作为抗原来源可避免操纵活病毒的潜在风险[20]。 p22 蛋白为ASFV 的结构蛋白，根据序列分析比较，东欧等地区ASFV 分离株中的p22 序列保守，证明p22蛋白是抗原稳定的，因此适合用作开发新的血清诊断试验的工具[21]。 目前对于p22 蛋白的功能研究尚不完善，其生物学功能仍待阐明。

原核表达系统具有操作简单、表达量高的特点，本研究中所用的原核表达载体pET-32a 可在BL21(DE3)细菌中高度表达，并且可以在裂解物的上清液中检测到大量目标蛋白，大大简化了纯化过程，同时避免了由包涵体的变性和复性可能引起的活性损失[22]。 虽然从构象结构上看，原核表达与真核表达的抗原会有差异，但不会影响抗原的线性表位[23]，因此，使用原核表达系统制备单克隆抗体仍可继续进行线性表位的筛选，为ASFV 结构功能的研究提供生物学材料。

单克隆抗体(MAb)是诊断病毒感染的关键试剂。 与多克隆抗体相比，MAb 在现代免疫诊断的应用中表现出特异性强、灵敏度高等优势，在疾病预防、诊断、治疗和流行病学调查等研究中发挥了巨大作用。 张冯禧等[24]通过原核表达系统获得ASFV p30 重组蛋白并制备了MAb，效价为1∶102 400，表明该蛋白有良好的免疫原性。 齐艳丽等[25]通过原核表达系统表达纯化了ASFV p54重组蛋白并制备了MAb，抗体ELISA 效价均高于1∶25 600 且特异性良好。

本研究通过大肠杆菌表达系统成功表达并纯化出一种可溶性重组蛋白p22，并制备了两株针对该蛋白的MAb。 经SDS-PAGE 和Western blot共同分析，重组蛋白大小约为37 kDa，将纯化的重组蛋白做免疫原免疫小鼠，得到抗体的ELISA效价不低于1∶256 000，说明制备的MAb 具有良好的免疫原性，为p22 蛋白的结构功能等基础研究以及ASFV 免疫类诊断试剂产品的开发提供了重要的生物材料。