群体感应分子3OC12HSL 对猪回肠上皮细胞IPI-2I 的影响

高前磊， 李川皓，陈帅，李海花，张相伦，袁震，盛清凯

(1. 天津农学院动物科学与动物医学学院/天津市农业动物繁殖与健康养殖重点实验室，天津 300384；2. 山东省农业科学院畜牧兽医研究所/山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，山东 济南 250100；3. 山东鑫基牧业有限公司，山东 泰安 271200)

肠道是动物机体消化吸收的主要场所，也是机体重要的免疫器官[1]，肠道屏障作为防御肠腔毒素和病原微生物的重要防线，其遭到破坏会导致抗原向固有层渗透，引发炎症级联反应，从而引起肠道炎症，诱发动物疾病，降低生产性能[2]。群体感应是菌群之间的一种通讯机制，细菌根据种群密度在细胞内或细胞间交换信息、协调群体行为、调节基因表达[3]。 细菌群落达到一定密度时，细菌会产生小分子物质并向外界释放，当环境中信号分子富集浓度达到一定阈值时，会进入细菌细胞内与胞内受体结合调控相关基因的表达，使细菌群落出现新的群体行为，如生物发光、毒力因子的分泌、生物被膜的形成、抗生素抗性和运动等[4-6]。 铜绿假单胞菌产生的群体感应分子3OC12HSL 在以往的研究中较为集中，发现其可以对多种细胞类型发挥细胞毒性，诱导细胞凋亡，破坏细胞间连接，促进细菌透过内皮屏障[7]。3OC12HSL 在宿主体多个部位被检测到，Xue等[8]在小鼠肠道、血清、肝脏中检测到群体感应分子，在无菌小鼠中未检测到。 不同研究结果显示，3OC12HSL 的作用效果并非一致，不同物种、不同细胞间存在差异。 本试验选用猪回肠上皮IPI-2I 细胞，探讨3OC12HSL 对IPI-2I 细胞的影响及机制，以期为促进畜禽健康养殖生产提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试细胞:猪IPI-2I 回肠上皮细胞系购自上海煊雅生物科技有限公司。

主要试剂:3OC12HSL、DMSO 购自Sigma 公司；胎牛血清(FBS)为Ausbian 品牌；RPMI1640培养液购自Gibco 公司；AnnexinV 凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞增殖活性检测试剂盒(CCK-8)购自日本同仁化学研究所；白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)、白介素1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)ELISA 试剂盒均购自武汉基因美生物技术公司；细胞总RNA 提取试剂盒及反转录试剂盒均购自南京诺威赞生物科技股份有限公司。

主要仪器:荧光定量PCR 仪(瑞士，罗氏)，流式细胞仪(美国，BD Biosciences)，酶标仪(美国，伯腾)，倒置相差显微镜(日本，Nikon)，CO2细胞培养箱(美国，Thermo)，超高速离心机(德国，Eppendorf)。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养和试验分组 将液氮保存的IPI-2I 细胞37 ℃水浴复苏后接种于25 cm2细胞培养瓶培养，当细胞长至70%时，用0.25%胰蛋白酶(含0.02% EDTA)消化液消化，细胞密度调至105个/mL 接种，96 孔板每孔100 μL，25 cm2培养瓶每瓶4 mL，在37 ℃、5% 浓度CO2培养箱内培养。细胞生长至70%时进行试验。 3OC12HSL 用DMSO 溶解，试验组加入3OC12HSL 溶液，使各组终浓度分别为50、100、200、400 μmol/L，DMSO 浓度控制在0.1%。 对照组加入细胞培养液，其中DMSO 含量为0.1%。

1.2.2 CCK-8 法检测细胞活性 将IPI-2I 细胞接种于96 孔板，分别用0、50、100、200、400 μmol/L的3OC12HSL 处理细胞，每组设6 个重复，分别培养4、8、12、24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，培养箱孵育2 h，用酶标仪测定450 nm 处各孔吸光度值，计算细胞活性。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 将IPI-2I 细胞接种于25 cm2培养瓶中，分别用0、50、100、200、400、800 μmol/L 的3OC12HSL 处理细胞12 h，倒掉培养液，PBS 冲洗3 次，加入1 mL 胰蛋白酶37 ℃消化5 min 后，加入1 mL 含胎牛血清的细胞培养液轻轻吹打未脱壁细胞，收集细胞悬液，1 000 r/min 离心5 min，去上清，加入100 μL缓冲液重悬细胞，加入5 μL FITC，轻轻混匀，加入10 μL PI 染液，25 ℃孵育10 min，流式细胞仪上机检测细胞凋亡。

1.2.4 ELISA 法检测炎症因子 将IPI-2I 细胞接种于6 孔板中，每孔重复3 次，分别用0、50、100、200、400 μmol/L 的3OC12HSL 处理细胞12 h，收集细胞培养液，使用ELISA 试剂盒检测培养液中IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α的含量。

1.2.5 实时荧光定量RT-PCR 检测mRNA 表达水平 细胞培养与处理方法同1.2.4。 RT-PCR引物利用Primer 5.0 软件设计，由上海生物工程有限公司合成。 利用试剂盒提取细胞内总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA 纯度和完整性。 按反转录试剂盒说明书将总RNA 反转录为cDNA。RT-PCR 反应体系为20 μL，根据试剂盒说明书配制，反应程序为:95 ℃预变性30 s；95 ℃10 s，60 ℃30s，40个循环；95℃15s，60℃60s，95 ℃15 s。 以GAPHD作为内参照基因，所用引物见表1，用2-△△Ct计算mRNA 的相对表达量。

1.3 数据统计分析

采用GraphPad Prism 9.0 软件进行统计分析作图，组间比较采用ANOVA 分析，进一步比较采用LSD 检验，P＜0.05 为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 3OC12HSL 对IPI-2I 细胞活性的影响

不同浓度3OC12HSL 分别处理IPI-2I 细胞不同时间，CCK-8 检测结果发现，随着3OC12HSL 浓度的增加和作用时间的延长，细胞活性逐渐降低。 如图1所示，作用时间为4 h，各组之间细胞活性没有显著差异；作用时间8 h、浓度为200 μmol/L 时，细胞活性较对照极显著下降(P＜0.01)；作用时间延长至12 h，浓度为400 μmol/L 时，细胞活性降至对照组的50%以下；进一步延长作用时间至24 h，细胞活性未继续下降。 3OC12HSL 浓度为400 μmol/L、作用时间为8 h时，细胞活性极显著降低(P＜0.01)，12 h 时降到最低，继续延长作用时间，细胞活性无显著变化。 结果显示，3OC12HSL 对IPI-2I 抑制效果呈时间与浓度依赖性。

图1 3OC12HSL 浓度和作用时间对细胞活性的影响

2.2 3OC12HSL 对IPI-2I 细胞凋亡的影响

利用流式细胞仪检测不同浓度3OC12HSL 作用12 h 时对IPI-2I 细胞凋亡的影响(图2)，结果显示，与对照组相比，100 μmol/L 3OC12HSL 极显著增加细胞凋亡率(P＜0.01)。 随着浓度增加，细胞凋亡率进一步增大，浓度达到800 μmol/L 时，细胞凋亡比例达到17.24%。 说明3OC12HSL 可以诱导IPI-2I 细胞凋亡，其浓度越高细胞凋亡率也越高。

2.3 3OC12HSL 对IPI-2I 细胞炎症因子的影响

ELISA 检测结果显示(图3)，与对照组相比，200 μmol/L 3OC12HSL 处理细胞后，细胞培养液中IL-6、IL-8、IL-1、TNF-α的浓度极显著增加(P＜0.01)，随3OC12HSL 作用浓度增大，炎症因子浓度进一步升高。 与200 μmol/L 浓度处理相比，400 μmol/L 3OC12HSL 处理的炎症因子浓度差异不显著(P＞0.05)。 表明3OC12HSL 可以促进IPI-2I 细胞发生炎症反应。

图3 3OC12HSL 对细胞炎症因子的影响

2.4 3OC12HSL 对IPI-2I 细胞凋亡相关基因mRNA 表达的影响

利用RT-PCR 检测不同浓度3OC12HSL 作用12 h 后细胞Fas、Caspase3、Caspase8、Bax、Bcl-2基因mRNA 相对表达量。 结果(图4)显示，与对照组相比，3OC12HSL 浓度达到100 μmol/L 时显著提高Bax基因mRNA 相对表达量(P＜0.05)，达到400 μmol/L 时显著降低Bcl-2基因mRNA 相对表达量(P＜0.05)，达到50 μmol/L 时分别极显著和显著提高Fas(P＜0.01)、Caspase8(P＜0.05)基因的mRNA 表达水平，浓度达到100 μmol/L 时可极显著提高Caspase3基因mRNA 相对表达量(P＜0.01)。 表明3OC12HSL 可能通过线粒体介导的内源性凋亡途径和Fas/Fasl介导的外源性凋亡途径诱导IPI-2I细胞凋亡。

图4 3OC12HSL 对细胞凋亡基因mRNA 表达水平的影响

3 讨论与结论

铜绿假单胞菌是畜禽肠道常见的条件致病菌，可引起宿主多个部位感染，其群体感应系统主要分泌3OC12HSL 和C4HSL 两种群体感应分子，它们参与铜绿假单胞菌一系列生理过程的调节和与外界的信息交流[9]。 3OC12HSL 除了参与发挥细菌的致病作用，还可影响宿主细胞的功能及基因表达。 肠道是营养物质消化吸收的主要场所，肠道中聚集着大量的菌群，参与宿主免疫、代谢、内分泌等生理功能[10]。 肠道菌群产生的代谢物也影响着宿主，当肠道上皮细胞受损，肠黏膜屏障受到破坏[11]，会加剧宿主感染风险。 3OC12HSL作为脂溶性小分子，可以进入肠道上皮细胞，影响肠道细胞正常的生理功能，引起细胞凋亡，破坏肠道屏障。 Taguchi 等[12]利用低浓度3OC12HSL 作用于未分化的Caco-2 细胞，可使细胞活性降低，诱导细胞凋亡，通过抑制Akt 磷酸化增加细胞存活率，说明3OC12HSL 通过靶向促进Akt 磷酸化，引起细胞死亡。 Shimizu 等[13]发现低浓度的3OC12HSL 可以通过激活ERK1/2 途径，减少黏糖蛋白(MUC3)的产生，进一步引起Caco-2 的凋亡。 Schwarzer 等[14]在3OC12HSL 诱导的呼吸道上皮细胞凋亡中发现，3OC12HSL 通过调控细胞内Ca2+的信号传导促进凋亡，使用Ca2+抑制剂预处理10 min，可以保护呼吸道上皮屏障，显著减少细胞死亡。 Nishimura-Danjobara等[15]发现3OC12HSL 可以干扰大鼠胸腺淋巴细胞膜对钾离子的通透性，引起细胞膜超极化，扰乱淋巴细胞正常功能，表明3OC12HSL 可能通过影响宿主细胞内外的离子浓度发挥功能。 本研究中，3OC12HSL 以浓度和时间依赖性降低IPI-2I 细胞活性，引起细胞凋亡，表明3OC12HSL 对不同细胞的影响可能与物种、器官、剂量及作用时间有关。

动物机体促炎因子和抗炎因子的失调会引起宿主炎症反应，炎症性肠炎可破坏肠黏膜屏障，增加肠道通透性，扰乱肠黏膜免疫系统，破坏菌群平衡，最终引起肠道菌群失调，进而引起一系列肠道疾病，因此，维持肠道屏障的完整性对动物体的健康至关重要。 研究发现，3OC12HSL 对宿主免疫细胞具有多种调控功能，能够调控宿主细胞炎症反应，影响宿主固有免疫[16]。 Rahbari 等[17]研究表明，化脓性链球菌利用细菌群体感应系统产生的3OC12HSL，通过抑制巨噬细胞和树突状细胞中NF-kβ 蛋白活性，显著降低细胞液中TNF-α和IL-6 表达水平，减少促炎因子的浓度，减弱宿主对病原菌的抵抗。 Jahoor 等[18]发现3OC12HSL增加了小鼠成纤维细胞和人上皮细胞中促炎因子mRNA 的水平，提出细胞PPAR 受体可能作为3OC12HSL 的靶点调控宿主的基因表达，这种促炎反应和抑炎反应的表现可能与细胞类型不同有关系。 Glucksam-Galnoy 等[19]发现铜绿假单胞菌产生的 3OC12HSL 以剂量依赖的方式对RAW264.7 小鼠巨噬细胞产生炎症反应，降低促炎因子TNF-α的浓度，提高抑炎因子IL-10 的浓度。 本研究中发现IPI-2I 细胞在3OC12HSL 影响下显著增加IL-6、IL-8、IL-1、TNF-α的浓度，表明3OC12HSL 可诱导细胞炎症反应。

细胞凋亡是真核细胞生物中一种程序性死亡，对维持机体内环境稳态和发育具有重要作用，主要包括内源性途径和外源性途径[20]。 内源性途径由线粒体介导，可由多种因素诱导发生，引起促凋亡蛋白Bax 寡居化，增加线粒体膜的通透性，细胞色素c 透过细胞膜进入细胞质， 激活Caspase9，继而活化Caspase3，活化的Caspase3 可以直接降解细胞内的结构蛋白和功能蛋白，从而导致细胞凋亡[21]。 线粒体内抗凋亡蛋白Bcl-2可抑制Bax 的寡聚化，保持线粒体膜的完整性，阻止细胞凋亡[22]，细胞内Bcl-2 和Bax 的表达比例对细胞凋亡有重要意义。 本研究中3OC12HSL 作用IPI-2I 细胞，Bcl-2的mRNA 表达量降低，Bax的表达量升高，说明3OC12HSL 可以通过调控线粒体介导的Bcl-2家族抗凋亡和促凋亡基因的表达量，诱导细胞的凋亡。 外源性凋亡途径由膜受体与配件结合传递凋亡信号，激活胞内信号级联反应，引起细胞凋亡，死亡受体Fas 作为上游信号分子与其配体FasL 结合，招募死亡结构域蛋白(FADD)，与Caspase8 酶原形成死亡诱导信号复合物(DISC)，活化Caspase8 酶原，激活Caspase3，启动细胞凋亡[23]。 Shin 等[24]研究发现，LPS 与3OC12HSL 联合作用于人脐带静脉内皮细胞可加剧细胞凋亡，3OC12HSL 激活受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)通路，导致Caspase8和Caspase3水平的增加，用RIPK1 抑制剂作用后可减少细胞死亡。 Woo 等[25]发现3OC12HSL 可导致Ca2+外流和Caspase12活化，通过活性氧(ROS)损伤线粒体功能，导致细胞色素c 外漏，增加Caspase3，Caspase8，Caspase9的mRNA 表达量，进而引起细胞凋亡。 本研究发现，3OC12HSL 作用可以显著增加Fas、Caspase8的mRNA 的表达水平，表明3OC12HSL 可以通过Fas/FasL凋亡途径诱导细胞凋亡。

本研究结果表明，一定浓度的群体感应分子3OC12HSL 导致猪回肠上皮细胞多种促炎性因子的表达，能够通过激活线粒体介导的内源性凋亡途径和Fas/FasL介导的外源性凋亡途径，促进肠道上皮细胞的凋亡，损伤肠道屏障功能，为后续开发群体感应抑制剂提供参考。