皮敏消胶囊对特应性皮炎小鼠皮损的改善作用

高 娟，谭 伟，陈桂芳，兰家琴，张 祎*，王睿睿*，饶高雄

（1.云南中医药大学，云南 昆明 650500； 2.云南省民族特色养生理论与健康产品工程实验室，云南 昆明 650500）

特应性皮炎是一种常见的慢性皮肤炎症性疾病，病程迁延难愈，其特征是皮肤持续瘙痒［1-2］，严重影响患者的生活质量。近年来其患病率在全世界范围内不断上升，约25%的儿童和2% ～3%的成人受到影响［3-5］。

中医药治疗特应性皮炎可追溯至上千年前，病因多以患儿先天禀赋不足，后天脾胃虚弱，加之嗜食肥甘厚味，致脾胃受损，湿邪壅塞，进而发病的皮肤疾患［6］。其治疗多从健脾助运和胃治湿，达木清心调畅情志，补气固表宣肺，温阳滋阴固本达到治疗效果［7］。也有近代医家从本滋养先天，顾护脾胃到标祛风止痒，清热利湿，滋阴润燥，凉血止血，使患者全身气机得以调达，三焦通畅［8］。皮敏消胶囊主要由苦参、白鲜皮、黄柏、黄芩、黄连等组成。湿邪易阻遏气机夹杂他邪而入，湿邪与风邪相合犹如水得风行，助内湿行于周身则痒见全身，苦参、白鲜皮、黄连、黄柏、黄芩清热燥湿祛风止痒，使三焦水道得以调达，湿邪不为水患，则病自消［9-10］，诸药合用从湿论治，通过其祛风除湿、清热解毒、凉血止痒、消肿散结效果达到治疗特应性皮炎效果［11］。该制剂临床疗效显著，常用于治疗湿疹、银屑病、慢性荨麻疹等皮肤疾病［12］。本研究主要探讨皮敏消胶囊对特应性皮炎小鼠的初步作用机制。

1 材料

1.1 动物 SPF 级雌性BALB/c 小鼠60 只，6～8 周龄，体质量（20±2） g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司［实验动物生产许可证号SCXK （湘） 2019-0004］，饲养在温度（22 ± 2）℃，相对湿度40% ～70%，噪音≤50 dB，昼夜12 h/12 h 循环的环境，自由进食和饮水，适应性喂养1周后进行实验。本研究动物实验经动物伦理委员会批准（伦理号R-062021001）。

1.2 试剂与药物 皮敏消胶囊（国药准字Z10950057，四川德峰药业有限公司） 溶于0.5% CMC-Na 溶液，配制成质量浓度分别为0.4、0.8、1.6 g/kg 的混悬溶液，即为低、中、高剂量。氯雷他定片（国药准字H20070030，西安杨森制药有限公司），溶于0.5% CMC-Na 溶液，配制成质量浓度为1.67 mg/kg 的混悬溶液。羧甲基纤维素钠（CMCNa） （批号20200330，天津市光复精细化工研究所）； PBS溶液（货号AF29449009，美国HyClone 公司）； 小鼠免疫球蛋白E （IgE）、白细胞介素4 （IL-4）、白细胞介素13（IL-13）、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP） ELISA 试剂盒、BCA 蛋白试剂盒 （货号210071406M、210071413M、210071416M、210071409M、210425B，江苏酶免实业有限公司）； 实验相关抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 仪器 Spark 10M 型多功能酶标仪（瑞士Tecan 公司）； Forma 902 型-80 ℃超低温冰箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）； 5810R 型低温高速离心机 （德国Eppendorf 公司）； AR224CN 型电子分析天平［奥豪斯仪器（上海） 有限公司］； SQS-1000/SQS-1000 型玻片扫描影像系统（深圳市生强科技有限公司）； Metr-ISO 型游标卡尺［上海美耐特实业（集团） 有限公司］。

2 方法

2.1 分组、造模及给药 将60 只小鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、氯雷他定（1.67 mg/kg） 组和皮敏消胶囊低、中、高（0.4、0.8、1.6 g/kg） 剂量组，每组10只。参照文献［10］ 报道方法进行特应性皮炎小鼠造模，实验前1 d 去除小鼠背部毛发（2 cm × 3 cm），实验第1、3 天，除对照组外，其余各组小鼠分别用100、50 μL 1%DNCB 涂于小鼠背部脱毛区及右耳，从第7 天开始改为0.5% DNCB 隔天涂抹1 次； 对照组涂抹相应的基质溶液（丙酮-橄榄油＝3 ∶1），小鼠背部出现脱屑、红斑、水肿、结痂等情况视为造模成功。每次涂抹0.5% DNCB 后8 h，皮敏消胶囊各剂量组和氯雷他定组灌胃相应剂量药物； 对照组和模型组灌胃0.5%CMC-Na 溶液，每天1 次，持续给药21 d。

2.2 小鼠皮炎评分 拍照并观察各组小鼠背部皮损的大体表现，参考文献［13］ 报道评估小鼠背部皮损严重程度，以4 种症状（红斑/出血、水肿/丘疹、表皮剥落/抓痕、磷屑/干燥） 进行评判，严重程度分别为0 （无）、1 （轻度）、2 （中度）、3 （重度） 分。

2.3 小鼠耳片肿胀度及脏器系数测定 选取小鼠耳部正中部位，使用游标卡尺测量左耳和右耳厚度，每只耳部测量3 次，公式为肿胀度＝右耳厚度-左耳厚度，取平均值进行统计分析。于实验第21 天，称定小鼠体质量，麻醉小鼠后，摘取脾脏和胸腺并称定质量，公式为脏器系数＝脏器质量/体质量。

2.4 小鼠血清总IgE、IL-4、IL-13 水平检测 小鼠麻醉后腹主动脉取血，4 ℃、3 000 r/min 离心10 min，分离得到血清，按照ELISA 试剂盒说明书检测血清总IgE、IL-4、IL-13 水平。

2.5 HE、TB 染色检测皮肤组织病理变化及肥大细胞浸润情况 小鼠采血后，取背部皮肤经打孔器制成大小一致的多块皮肤组织，尽量展平皮肤，一部分置于-80 ℃冰箱中保存备用，另一部分用4%多聚甲醛溶液固定48 h，然后经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后，行苏木精-伊红（HE）染色及甲苯胺蓝（TB） 染色，封片后于显微镜下观察，采用玻片扫描成像系统截图分析。肥大细胞被染成蓝紫色，随机选择同一放大倍数下8 个视野，并用Image J 软件测量皮肤厚度，计算肥大细胞数目。

2.6 免疫组化法检测皮损组织TSLP、IL-4、IL-13 表达取“2.5” 项下石蜡切片，脱蜡、抗原修复后加入一抗，4 ℃孵育过夜，清洗后加二抗，室温孵育30 min，DAB 显色后封片，于显微镜下观察，采用玻片扫描成像系统采集图像并分析。

2.7 皮损组织TSLP、IL-4、IL-13 水平检测 取一块小鼠背部皮损皮肤，加PBS 冰浴研磨，4 ℃、5 000 r/min 离心10 min，取组织上清液，按照ELISA 试剂盒说明书检测皮损组织匀浆TSLP、IL-4、IL-13 水平。

2.8 统计学分析 通过Graphpad Prism 8.0.2 软件进行处理，数据以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 小鼠背部皮损表观 对照组小鼠皮肤正常，毛发增生且光滑； 模型组小鼠出现不同程度的脱屑、红斑、水肿且有渗出物、结痂； 氯雷他定组皮损程度减轻； 皮敏消胶囊各剂量组皮损也有所改善，高剂量组作用效果最明显，见图1。

图1 各组小鼠皮损表观

3.2 皮敏消胶囊对特应性皮炎小鼠皮炎评分的影响 与对照组比较，模型组小鼠皮炎评分增加（P＜0.01）； 与模型组比较，氯雷他定组和皮敏消胶囊各剂量组小鼠皮炎评分均降低（P＜0.05，P＜0.01），且皮敏消胶囊的作用呈剂量依赖性，见表1。

表1 各组小鼠皮炎评分比较（±s，n＝8）

表1 各组小鼠皮炎评分比较（±s，n＝8）

注： 与对照组比较，＃＃P＜0.01； 与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别皮炎评分/分0 d4 d10 d18 d21 d对照组0.000±0.0000.000±0.0000.000±0.0000.000±0.0000.000±0.000模型组0.000±0.0004.308±0.480＃＃3.154±0.801＃＃2.846±0.801＃＃3.308±0.751＃＃氯雷他定组0.000±0.0003.615±0.650*1.692±0.751**1.308±0.480**1.462±0.519**皮敏消胶囊高剂量组0.000±0.0003.333±0.500**1.556±0.726**1.111±0.333**1.111±0.333**皮敏消胶囊中剂量组0.000±0.0003.385±0.506**1.846±0.689**1.308±0.480**1.231±0.439**皮敏消胶囊低剂量组0.000±0.0003.667±0.707*2.111±0.601**1.667±0.500**1.556±0.527**

3.3 皮敏消胶囊对特应性皮炎小鼠耳肿胀度的影响 与对照组比较，模型组小鼠耳肿胀度增加（P＜0.01）； 与模型组比较，氯雷他定组和皮敏消胶囊各剂量组小鼠耳肿胀度降低（P＜0.01），见表2。

表2 各组小鼠耳肿胀度比较（±s，n＝8）

表2 各组小鼠耳肿胀度比较（±s，n＝8）

注： 与对照组比较，＃＃P＜0.01； 与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别耳肿胀度/mm 0 d4 d6 d18 d21 d对照组0.000±0.0000.000±0.0000.001±0.0030.002±0.0040.002±0.004模型组0.000±0.0000.026±0.014＃＃0.118±0.040＃＃0.102±0.030＃＃0.131±0.041＃＃氯雷他定组0.000±0.0000.010±0.0060.022±0.012**0.048±0.028**0.038±0.025**皮敏消胶囊高剂量组0.000±0.0000.013±0.0100.020±0.016**0.063±0.021**0.034±0.020**皮敏消胶囊中剂量组0.000±0.0000.018±0.0170.017±0.007**0.080±0.013*0.020±0.017**皮敏消胶囊低剂量组0.000±0.0000.014±0.0050.044±0.022**0.076±0.021*0.028±0.011**

3.4 皮敏消胶囊对特应性皮炎小鼠皮损组织病理学的影响 对照组小鼠皮肤结构完整； 与对照组比较，模型组小鼠皮肤角化过度、角化不全，表皮增厚（P＜0.01），颗粒层、棘层肥大，基底层下移，真皮层淋巴细胞、嗜酸性细胞、肥大细胞浸润增加，细胞间炎性水肿等皮炎样病变； 与模型组比较，氯雷他定组和皮敏消胶囊各剂量组小鼠特应性皮炎症状有所改善，表皮增厚减少（P＜0.01），真皮层炎症细胞及肥大细胞浸润减少，毛囊、皮脂腺等附属结构增加，见图2。

图2 皮敏消胶囊对特应性皮炎小鼠皮损组织病理学的影响（HE，×200，±s，n＝8）

3.5 皮敏消胶囊对特应性皮炎小鼠皮损组织肥大细胞浸润的影响 与对照组比较，模型组小鼠真皮层中肥大细胞浸润增加，肥大细胞数目增加（P＜0.01）； 与模型组比较，氯雷他定组和皮敏消胶囊各剂量组小鼠肥大细胞浸润减少，肥大细胞数目也减少（P＜0.01），见图3。结果提示，皮敏消胶囊可能是通过调控肥大细胞干预小鼠特应性皮炎。

图3 皮敏消胶囊对特应性皮炎小鼠皮损组织肥大细胞浸润的影响（TB，×200，±s，n＝8）

3.6 皮敏消胶囊对特应性皮炎小鼠脏器系数的影响 与对照组比较，模型组小鼠脾脏指数升高（P＜0.01），胸腺指数无明显变化（P＞0.05）； 与模型组比较，氯雷他定组和皮敏消各剂量组小鼠脾脏指数均降低（P＜0.05，P＜0.01），而胸腺指数则无明显变化（P＞0.05），见图4。结果提示，皮敏消胶囊可能通过T 细胞调节特应性皮炎小鼠体液免疫而发挥作用。

图4 皮敏消胶囊对特应性皮炎小鼠脏器系数的影响（±s，n＝8）

3.7 皮敏消胶囊对特应性皮炎小鼠外周血总IgE、IL-4、IL-13 水平的影响 与对照组比较，模型组小鼠血清总IgE、IL-4、IL-13 水平升高（P＜0.01）； 与模型组比较，氯雷他定组和皮敏消胶囊各剂量组小鼠血清总IgE、IL-4、IL-13 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），且皮敏消胶囊的作用呈剂量依赖性，见图5。

图5 皮敏消胶囊对特应性皮炎小鼠外周血总IgE、IL-4、IL-13 水平的影响（±s，n＝8）

3.8 皮敏消胶囊对特应性皮炎小鼠皮损组织TSLP、IL-4、IL-13 表达的影响 TSLP、IL-4、IL-13 阳性表达呈棕黄色染色，主要集中在表皮颗粒层、棘层，真皮层乳头层、毛囊及皮脂腺，胞浆、胞核及胞膜少量着色。对照组阳性表达较少； 与对照组比较，模型组小鼠皮损组织TSLP、IL-4、IL-13 表达增加； 与模型组比较，氯雷他定组和皮敏消胶囊各剂量组小鼠皮损组织TSLP、IL-4、IL-13 表达减少，见图6。

图6 皮敏消胶囊对特应性皮炎小鼠皮损组织TSLP、IL-4、IL-13 表达的影响（IHC，×200）

3.9 皮敏消胶囊对特应性皮炎小鼠皮损组织TSLP、IL-4、IL-13 水平的影响 与对照组比较，模型组小鼠皮损组织TSLP、IL-4、IL-13 水平升高（P＜0.01）； 与模型组比较，氯雷他定组和皮敏消胶囊各剂量组小鼠皮损组织TSLP、IL-13 水平降低（P＜0.01），IL-4 水平无明显变化（P＞0.05），见图7。

4 讨论

特应性皮炎是一种以湿疹和严重瘙痒为特征的慢性炎症性皮肤病，其发病机制是宿主免疫系统、皮肤屏障缺陷和瘙痒等相互作用的结果［14-15］。当抗原入侵，皮肤屏障会遭到破坏，外来抗原最初激发Th1，而重复激发会导致Th1型向Th2 型反应转变； 抗原还可通过皮肤表面朗格汉斯细胞上的胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP） 受体直接诱导Th2 细胞因子IL-4、IL-13 分泌。此外，TSLP 还能促进嗜酸性粒细胞的活化，增强IL-4、IL-13 的表达［16］。IL-4、IL-13也影响IgE 的合成和嗜酸性粒细胞的趋化［17］。特应性皮炎患者常见血清中总IgE 水平升高，IgE 通过介导肥大细胞的激活，分泌Th2 细胞因子IL-4、IL-13。肥大细胞在急性特应性皮炎中主要呈脱颗粒状态，而在慢性期数量增加，积聚于乳头状真皮层中。在特应性皮炎的发病过程中既是效应细胞又是调节细胞，肥大细胞可通过其表面高亲和力IgE受体（Fc-εRI） 致敏，当与结合的IgE 特异性抗原相遇时，释放颗粒介质，由花生四烯酸合成前列腺素和白三烯，产生多种细胞因子，如IL-4、IL-13，增强T 细胞活化，调节原代B 细胞发育并刺激B 细胞中IgE 的合成［18］。

抗组胺药、糖皮质激素、免疫抑制剂等是目前临床上常用的特应性皮炎治疗药物，虽然临床运用广泛，但长期使用副作用明显，复发率高，患者依从性较差［19］。中医学对皮肤病的治疗历史悠久，不同学派治疗特应性皮炎的疗效均较显著。中医学认为特应性皮炎多由先天胎毒遗热，后天脏腑失调及外感风湿热邪，三者交叉错杂而引起，病性属本虚标实。但其核心病机乃脾虚和心火，脾虚生内湿，浸淫肌肤，心火致郁热，疮生痒甚，与外邪相合终致疾病反复发作，临证可以从健脾清心祛邪角度进行论治［20］。皮敏消胶囊源自古方“消风散”，由苦参、苍术、防风、荆芥、白鲜皮、蜈蚣、地黄、蒲公英、黄芩、牡丹皮、蝉蜕、紫草、地骨皮等21 味中药材组成，全方具有祛风除湿、清热解毒、泻火止痒的功效，还可以促进血流运转、巩固中气、外透风邪、内清里热、驱邪外出，调和阴阳。皮敏消胶囊在临床治疗成人特应性皮炎效果良好，不良反应发生率低，在临床治疗中具有很好的推广价值［21］。

本研究采用DNCB 诱导BALB/c 小鼠建立特应性皮炎模型，结果显示皮敏消胶囊一方面能改善特应性皮炎小鼠皮损病理特征，降低皮损组织TSLP 水平，调控Th2 型细胞因子IL-4、IL-13 的分泌； 另一方面还能降低特应性皮炎小鼠脾脏系数，调控B 细胞分化，降低血清总IgE 水平，减少肥大细胞活化。