大孔树脂分离纯化茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯工艺优化

曹 敏

（广西轻工业科学技术研究院有限公司，广西 南宁 530031）

茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称，主要由儿茶素类、花色素类、花黄素类、缩酸、缩酚酸类物质组成。其中，表没食子儿茶素没食子酸酯是儿茶素中含量最高、活性最强的成分，常占后者总量的50%［1］，具有特殊的立体化学结构、很强的抗氧化活性，在抗肿瘤、抗突变、抗衰老、抗炎、抗病毒等方面有着出色表现［2-6］，尤其是在治疗艾滋病方面，该成分能通过多种机制实现对HIV 感染的抑制［7-9］，并且它可作为肿瘤多耐药性的逆转剂，改善癌细胞对化疗的敏感性，并减轻对心脏的毒性［10］。

目前，表没食子儿茶素没食子酸酯高纯品售价一直居高不下，主要是由于其生产成本过高，故需优化其生产工艺以降低成本，从而更广泛地应用于医药、食品、日用化妆品等行业。因此，本实验优化大孔树脂分离纯化茶多酚中表没食子儿茶素没食子酸酯工艺，以期为该成分进一步的工业化应用奠定基础。

1 材料

Waters 515/2489 高效液相色谱仪，配置紫外吸收检测器（美国Waters 公司）； VWD 紫外检测器（美国安捷伦科技公司）； N4S 紫外可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）； AP135W 分析天平（十万分之一，日本岛津公司）； ZHWY-211B 恒温摇床（常州金坛精达仪器制造有限公司）； DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）； KQ3200DB 超声波提取仪（昆山市超声仪器有限公司）； CCT-3300 超纯水器（重庆力德高端水处理设备研发有限公司）； 玻璃层析柱（30 mm×600 mm，海门市三和新华玻璃试验仪器厂）。

表没食子儿茶素没食子酸酯对照品 （美国Cato Research Chemicals Inc 公司）； 98%茶多酚（四川畅维生物科技有限公司）。D101、HZ801、HZ816、HZ818 大孔树脂（上海华震科技有限公司）； AB-8、X-5 大孔树脂（天津市光复精细化工研究所）。甲醇为色谱纯［默克化工技术（上海）有限公司］； 冰醋酸为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）； 其他试剂均为分析纯； 水为高纯水（自制）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 在茶多酚粉末中加入适量纯水或乙醇，50 ℃水浴10 min，制成相应质量分数，即得。

2.2 对照品溶液制备 分别精密称取表没食子儿茶素没食子酸酯对照品4.88、3.90、2.93、2.20、1.10、0.55、0.28、0.14、0.07、0.03 mg，无水乙醇溶解并定容至5 mL量瓶中，摇匀，即得。

2.3 表没食子儿茶素没食子酸酯含量测定 采用HPLC 法。

2.3.1 色谱条件 参考文献［11］ 报道，Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相甲醇-水-醋酸（24 ∶75 ∶1）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温35 ℃；检测波长276 nm； 进样量10 μL； 运行时间14 min。

2.3.2 线性关系考察 取对照品溶液适量，0.22 μm 微孔滤膜过滤，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度（Y） 对峰面积（X） 进行回归，得方程为Y＝0.000 000 068X-0.000 79 （r＝0.999 95），在0.006～0.976 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.3.3 测定方法 取“2.1” 项下供试品溶液0.2 mL，无水乙醇定容至10 mL，在“2.3.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量［12］，公式为含量＝C×V1×V2/V3，其中C为表没食子儿茶素没食子酸酯质量浓度，V1为供试品溶液总体积，V2为待测液体积，V3为供试品溶液取样体积。

2.4 大孔树脂筛选

2.4.1 预处理 各大孔树脂用95%乙醇浸泡24 h，先用洗脱液洗至加入纯水不浑浊，再用纯水洗至无醇味。另外，由于上述树脂较干净，并且结合厂家提供的预处理方法，故均不使用酸或碱进行预处理，从而更环保。

2.4.2 静态吸附-解吸试验 参考文献［12］ 报道，并根据具体实验情况进行适当调整。按“2.1” 项下方法制备含10%茶多酚的供试品溶液（表没食子儿茶素没食子酸酯质量浓度为36.59 mg/mL），准确称取预处理后的6 种大孔树脂各10.0 g （沥干水分），置于锥形瓶中，加入30 mL 供试品溶液，封口，在恒温摇床（25 ℃、70 r/min） 上振荡吸附4 h，取出，滤过，少量纯水清洗表面附着的供试品溶液，合并滤液和清洗液，测定原液、合并液中表没食子儿茶素没食子酸酯含量，计算吸附量、吸附率，公式分别为吸附量＝M1-M2、吸附率＝ ［（M1-M2） /M1］ ×100%，其中M1为原液中表没食子儿茶素没食子酸酯含量，M2为合并液中表没食子儿茶素没食子酸酯含量。吸附后的大孔树脂用500 mL 50%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定表没食子儿茶素没食子酸酯洗脱量，计算解吸率，公式为解吸率＝［M3/ （M1-M2）］ ×100%，其中M3为洗脱液中表没食子儿茶素没食子酸酯含量。结果见表1。

表1 大孔树脂静态吸附-解吸试验结果

由此可知，弱极性大孔树脂对表没食子儿茶素没食子酸酯的吸附率、解吸率都比非极性大孔树脂低，这可能与该成分具有一定极性，较难被弱极性大孔树脂吸附，并且吸附后由于结合较牢，中等体积分数（50%左右） 乙醇不易洗脱有关； X-5 吸附量虽然达740.96 mg，仅次于HZ816，但其解吸率仅为25.53%； HZ818 解吸率虽然达91.75%，但其吸附率仅为49.61%； HZ816 吸附率、解吸率最高，在很大程度上保证了表没食子儿茶素没食子酸酯回收率、树脂使用寿命，故选择其进行后续考察。

2.4.3 静态吸附动力学研究 准确称取预处理好的HZ816大孔树脂10.0 g （沥干水分），置于锥形瓶中，加入30 mL含10%茶多酚的供试品溶液，封口，在恒温摇床（25 ℃、70 r/min） 上振荡吸附4 h，每20 min 取样1 次，测定吸附前后表没食子儿茶素没食子酸酯含量，计算树脂对该成分的比吸附量［公式为比吸附量＝ （C0-C1） ×V/M，其中C0为吸附前供试品溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯质量浓度，C1为吸附后供试品溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯含量，V为供试品溶液体积，M为大孔树脂湿重］，以吸附时间为横坐标，比吸附量为纵坐标绘制静态动力曲线［13］，见图1。由此可知，树脂比吸附量在前30 min 内升高程度较快，40 min 后趋于稳定，基本达到吸附平衡。

图1 静态吸附动力曲线

2.5 分离纯化工艺优化

2.5.1 单因素试验

2.5.1.1 上样量确定 准确称取HZ816 大孔树脂80.0 g（沥干水分） 共5 份，湿法装入玻璃层析柱（30 mm×600 mm） 中，分别以10%、20%、30%、40%、50% 乙醇溶解茶多酚粉末，制成5%乙醇溶液（表没食子儿茶素没食子酸酯质量浓度为20.93 mg/mL），以0.6 BV/h 速率上层析柱，收集流出液（5.0 mL/管），测定流出液中表没食子儿茶素没食子酸酯质量浓度，以流出体积为横坐标，流出液、上样液中表没食子儿茶素没食子酸酯质量浓度的比值（C/C0） 为纵坐标绘制动态吸附穿透曲线，见图2 （当C/C0＝0.1 时，树脂吸附达到渗透点［14-15］，此时应停止上样）。由此可知，乙醇体积分数越高，吸附能力越弱，渗透点越提前，这是由于乙醇具有一定的洗脱能力所致； 10%、20%、30%、40%、50%乙醇溶解的供试品溶液达到渗透点时，流出体积分别为208、178、167、138、93 mL，比吸附量分别为54.42、46.57、43.69、36.10、24.33 mg/g。再以比吸附量平均值41.02 mg/g 为上样量计算基数，为了保证分离效果，上样量应为树脂用量的10%左右，故其计算公式为上样量＝41.02×树脂用量×10%。

图2 动态吸附渗透曲线

2.5.1.2 洗脱体积确定 配制含10% 茶多酚的水溶液5份，每份3 mL，经HZ816 大孔树脂层析柱（沥干水后树脂质量为80.0 g），分别以20%、25%、30%、40%、50%、60%乙醇洗脱，洗脱速率为0.6 BV/h。以洗脱体积为横坐标，洗脱液中表没食子儿茶素没食子酸酯质量浓度为纵坐标绘制洗脱曲线［16］，结果见图3。由此可知，洗脱至4.0 BV时除了25%乙醇未能完全洗脱表没食子儿茶素没食子酸酯外，其他体积分数乙醇洗脱后该成分质量浓度均为0，综合考虑试剂节约及后续浓缩成本，洗脱体积以4.0 BV 为宜。

图3 表没食子儿茶素没食子酸酯洗脱曲线

2.5.1.3 茶多酚质量分数对表没食子儿茶素没食子酸酯纯度、洗脱率的影响 以30%乙醇为溶剂，配制5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20% 茶多酚乙醇溶液，分别取样3 mL，经HZ816 大孔树脂层析柱（沥干水后树脂质量为100 g），以0.6 BV/h 速率洗脱，收集洗脱液（4 mL/管），洗脱体积为4.0 BV，测定洗脱液中表没食子儿茶素没食子酸酯纯度，再合并洗脱液，测定该成分质量浓度，计算洗脱率，结果见图4。

图4 茶多酚质量分数对表没食子儿茶素没食子酸酯纯度、洗脱率的影响

“2.5.1.1” 项下结果显示，30% 乙醇配制的供试品溶液比吸附量在43.69 mg/g 左右，而上述质量分数茶多酚乙醇溶液中表没食子儿茶素没食子酸酯质量浓度分别为18.58、29.27、38.29、46.98、54.96、64.47、75.43 mg/mL。由此可知，表没食子儿茶素没食子酸酯质量浓度低于43.69 mg/mL 时，树脂吸附未饱和，纯度、洗脱率随着茶多酚质量浓度增加而升高； 超过43.69 mg/mL 时，树脂吸附饱和，未被吸附的溶液向下扩散吸附，使得分离区产生交叉混合，纯度、洗脱率随着茶多酚质量分数增加而降低。

2.5.1.4 乙醇体积分数对表没食子儿茶素没食子酸酯纯度、洗脱率的影响 配制10%茶多酚溶液9 份，每份3 mL，经HZ816 大孔树脂层析柱（沥干水后树脂质量为80.0 g），分别以20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%乙醇洗脱，洗脱速率为0.6 BV/h，洗脱体积为4.0 BV，收集洗脱液（4 mL/管），测定洗脱液中表没食子儿茶素没食子酸酯纯度，再合并洗脱液，测定该成分质量浓度，计算洗脱率，结果见图5。

图5 乙醇体积分数对表没食子儿茶素没食子酸酯纯度、洗脱率的影响

“2.5.1.2” 项下结果显示，乙醇体积分数越高，洗脱越集中，浓度越高，后续浓缩越节能。由此可知，20% 乙醇无法洗脱； 25%乙醇洗脱时表没食子儿茶素没食子酸酯纯度虽然较高，但其洗脱率仅为30%左右； 乙醇体积分数大于30%时，表没食子儿茶素没食子酸酯纯度呈降低趋势，在30% ～45%范围内更明显，大于45%后趋于稳定，而洗脱率在乙醇体积分数大于30%后趋于稳定。

2.5.1.5 洗脱速率对表没食子儿茶素没食子酸酯纯度、洗脱率的影响 配制10%茶多酚乙醇溶液（30%乙醇溶解），分别取样3 mL，经HZ816 大孔树脂层析柱（沥干水后树脂质量为80.0 g），4.0 BV 30% 乙醇分别以0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 BV/h 速率洗脱，收集洗脱液（4 mL/管），测定洗脱液中表没食子儿茶素没食子酸酯纯度，再合并洗脱液，测定该成分质量浓度，计算洗脱率，结果见图6。

图6 洗脱速率对表没食子儿茶素没食子酸酯纯度、洗脱率的影响

洗脱速率越大，洗脱时间、纯化时间越短，但纯度也会有所降低。由此可知，洗脱速率对表没食子儿茶素没食子酸酯纯度、洗脱率的影响较小，大于0.6 BV/h 后两者基本趋于稳定。

2.5.2 正交试验 在单因素试验基础上，以茶多酚质量分数（A）、乙醇体积分数（B）、洗脱速率（C） 为影响因素，按L16（45） 正交表［17］进行试验，因素水平见表2。

表2 因素水平

再以表没食子儿茶素没食子酸酯纯度（X）、洗脱率（Y） 的综合评分为评价指标，结合工艺特点，设定两者权重系数分别为0.6、0.4，计算综合评分，公式为综合评分＝ （0.6X/98.48+0.4Y/95.98） ×100，并进行直观分析、方差分析［18］。

直观分析（表3） 显示，各因素影响程度依次为B＞C＞A； 最优工艺为A3B2C2，即12.5%茶多酚乙醇溶液，上样量41.02 mg/g，4.0 BV 30%乙醇洗脱，洗脱速率0.6 BV/h。

表3 试验设计与结果

方差分析（表4） 显示，各因素影响程度依次为B＞C＞A； 因素A有显著影响（P＜0.05），B、C无显著影响（P＞0.05）； 最优工艺为A3B2C2，与直观分析结果一致。

表4 方差分析

2.5.3 验证试验 按“2.5.2” 项下优化工艺进行3 批验证试验，结果见表5，可知该工艺稳定可行。

表5 验证试验结果（n＝3）

2.6 树脂使用寿命测试 采用模拟移动床连续分离技术，对表没食子儿茶素没食子酸酯进行连续分离纯化中试试验，历时337 d、八千多个小时。到最后停机时，HZ816 大孔树脂一次分离得到的表没食子儿茶素没食子酸酯纯度达95.11%，回收率达78.99%，充分证明了该树脂具有优越的分离性能、较长的使用寿命，为其工业化应用奠定了基础。

3 讨论

本实验旨在筛选出可将模拟移动床分离技术应用于表没食子儿茶素没食子酸酯分离纯化的大孔树脂，它应对表没食子儿茶素没食子酸酯有着高吸附率、高解吸率，一次分离纯度高，使用寿命长。董海胜等［19］筛选出的ADS-7、NKA-Ⅱ大孔树脂对表没食子儿茶素没食子酸酯的吸附能力分别只有19.06、17.02 mg/g，虽然两者解吸率较高（分别为88%、92%），但由于乙醇体积分数过高（分别为60%、70%），导致该成分一次分离纯度只能达到67.9%，工业上需多步反复分离才能得到高纯度，而且树脂使用寿命未作进一步研究，故无论是吸附能力，还是富集表没食子儿茶素没食子酸酯的纯度，这2 种树脂都不适用于工业化生产。本研究最终筛选出的HZ816 大孔树脂对表没食子儿茶素没食子酸酯的吸附能力达41.02 mg/g，在单柱分离纯化试验中可将该成分纯度提高至93.13%，洗脱率达94.14%，一次性洗脱基本无残留，在一定程度上保证了该树脂可反复使用； 经过连续337 d 的模拟移动床中试分离试验后，该树脂仍可使表没食子儿茶素没食子酸酯纯度达95.11%，结晶后产品纯度达98.80%，一次分离回收率达78.99%，充分证明了其优越的分离性能，而且吸附容量高（处理能力强），分离所用的乙醇体积分数低（30%），最大程度降低了成本，可应用于工业化生产。