视力舒颗粒制备工艺优化及其物理指纹图谱建立

唐 茜，韩云凤，石 懿，杨春红，赖先荣*，张富文

（1.成都中医药大学，四川 成都 611137； 2.成都中医大银海眼科医院股份有限公司，四川 成都 610081）

视力舒处方为成都中医大瀛海眼科医院院内制剂，是根据陈达夫“补益肝肾、活血明目” 的近视治疗理念，以“驻景丸加减方” 为基础进行改进，用于能近怯远、目睫无力、视物昏花等症［1］，由菟丝子、楮实子、枸杞、山药、青皮、葛根等11 味中药组成，原方以汤剂形式服务于患者，多年临床应用效果满意，为了最大程度方便患者用药，课题组前期将其开发成颗粒剂。本实验优化视力舒颗粒制备工艺，并建立其物理指纹图谱，以期为该制剂新药开发及工业化生产提供参考。

1 材料

1.1 仪器 BSA124S 型、CPA225D 型电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京） 有限公司］； Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）； UPH-I-10T 型（优普） 纯水制造系统（成都超纯科技有限公司）； ZDHW 型调温电热套（北京中兴伟业仪器有限公司）； YC-500 实验室喷雾干燥机（上海雅程仪器设备有限公司）； DHG-9624A 电热恒温鼓风干燥箱（上海将任实验设备有限公司）； HCP108恒温恒湿箱（北京五洲东方科技发展有限公司）。

1.2 药材 菟丝子（批号200900671，产地辽宁）、枸杞子（批号201100371，产地宁夏）、炒茺蔚子 （批号200400771，产地四川）、麸炒山药（批号200700771，产地河南）、芡实（批号191003931，产地广东）、葛根（批号200901621，产地四川）、油松节（批号190800181，产地四川）、伸筋草 （批号200800261，产地四川）、炒楮实子（批号 200600201，产地湖北）、麸炒青皮 （ 批号200500531，产地四川） 均购自成都康美药业生产有限公司，经成都中医药大学张艺研究员鉴定为正品。炒楮实子、麸炒青皮符合2015 年版《四川省中药饮片炮制规范》 药用标准，其余药材均符合2020 年版《中国药典》 一部药用标准。

1.3 试剂 金丝桃苷 （批号DST201013-023，纯度≥98.0%）、葛根素 （批号DSTDG000201，纯度≥98.0%）、橙皮苷（批号DSTDG003801，纯度≥98.0%） 对照品均购自成都德思特生物技术有限公司。可溶性淀粉 （批号A16GS145576）、微晶纤维素（批号Z11N11W130285）、糊精（批号T02D11Z13024）、甘露醇（批号M24GS149532）均购自上海源叶生物科技有限公司； 蔗糖 （批号20130624） 购自成都市科龙化工试剂厂。乙腈、甲醇为色谱纯（美国赛默飞世尔科技公司）； 磷酸为色谱纯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）； 水为纯水。

2 方法与结果

2.1 浓缩液制备 按处方量称取11 味药材共150 g，加11倍量水煎煮3 次，每次80 min，合并滤液，过滤浓缩至相对密度为1.05～1.08，即得。

2.2 干膏粉制备 由于处方干膏得率较大，若采用稠浸膏制粒则辅料用量较多，从而加大了服药量，故选择制成干膏粉进行湿法制粒。前期发现，真空干燥得到的干膏黏性大，难以粉碎，故采用喷雾干燥。以葛根素、金丝桃苷、橙皮苷含量，物料干燥情况，出粉率为指标，设定喷雾压力为0.05 MPa，风机频率为40 Hz，蠕动速度为10 r/min，对喷雾干燥机进风口、出风口温度进行考察，结果见表1，最终确定两者分别为130、79 ℃。

表1 喷雾干燥机进风口、出风口温度考察结果

2.3 颗粒制备 将干膏粉与辅料混匀，乙醇润湿制软材，16 号筛摇摆制粒，干燥整粒，即得，平行制备15 批（编号SLS1～SLS15）。

2.4 评价指标选择及测定 颗粒成型率、吸湿率、休止角是评价成型工艺是否符合要求、颗粒品质稳定性、颗粒质量能否准确分装的关键指标［2-4］，金丝桃苷、葛根素、橙皮苷保留率是保证颗粒药效的重要指标，故本实验选择以上指标进行综合评价。

2.4.1 各成分含量测定 采用HPLC 法。

2.4.1.1 色谱条件 Swell Chromplus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相乙腈-0.1% 磷酸，梯度洗脱（0 ～10 min，5% ～10%乙腈； 10～20 min，10% ～17%乙腈； 20～40 min，17% ～25%乙腈； 40～45 min，25% ～5%乙腈）； 体积流量1.0 mL/min； 柱温30 ℃； 检测波长250 nm （金丝桃苷、葛根素）、280 nm （橙皮苷）； 进样量10 μL。

2.4.1.2 对照品溶液制备 分别精密称取对照品金丝桃苷0.92 mg、橙皮苷2.38 mg、葛根素4.99 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得。

2.4.1.3 供试品溶液制备 精密称取相当于0.5 g 干膏粉的颗粒适量，置于具塞锥形瓶中，加20 mL 甲醇，称定质量，超声（频率25 Hz，功率100 W） 处理1 h，放冷，称定质量，甲醇补足减失的质量，摇匀，过0.45 μm 微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4.1.4 阴性样品溶液制备 分别制备缺菟丝子、缺青皮、缺葛根的阴性样品，按 “2.4.1.3” 项下方法制备，即得。

2.4.1.5 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液各10 μL，在“2.4.1.1” 项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，该方法专属性良好。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.4.1.6 线性关系考察 精密吸取“2.4.1.2” 项下对照品溶液适量，甲醇稀释成6 个质量浓度，在“2.4.1.1” 项色谱条件下各进样10 μL 测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得各成分方程分别为金丝桃苷Y＝21.444X-0.964 2 （R2＝0.999 8），线性范围2.48 ～92.00 μg/mL； 葛根素Y＝39.523X+23.316（R2＝0.999 9），线性范围13.47 ～499.00 μg/mL； 橙皮苷Y＝15.307X+9.502 2 （R2＝0.999 8），线性范围6.43 ～238.00 μg/mL，均在各自范围线性关系良好。

2.4.1.7 精密度试验 精密吸取“2.4.1.2” 项下对照品溶液适量，在“2.4.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得金丝桃苷、橙皮苷、葛根素峰面积RSD 分别为1.88%、1.11%、1.02%，表明仪器精密度良好。

2.4.1.8 重复性试验 按“2.4.1.3” 项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.4.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得金丝桃苷、橙皮苷、葛根素含量RSD 分别为1.26%、1.06%、1.90%，表明该方法重复性良好。

2.4.1.9 稳定性试验 按“2.4.1.3” 项下方法制备供试品溶液，室温下于0、2、4、8、16、24 h 在“2.4.1.1” 项色谱条件下各进样10 μL 测定，测得金丝桃苷、橙皮苷、葛根素峰面积RSD 分别为2.37%、1.17%、0.85%，表明溶液在24 h 内稳定良好。

2.4.1.10 加样回收率试验 精密量取2 mL 各成分含量已知的供试品溶液6 份，按100%水平精密加入对照品溶液，在“2.4.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得金丝桃苷、葛根素、橙皮苷平均加样回收率分别为100.11%、101.84%、102.28%，RSD 分别为1.96%、1.77%、1.89%。

2.4.2 保留率测定 精密称取干膏粉0.5 g、相当于干膏粉0.5 g 的颗粒适量，按“2.4.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.4.1.1” 项色谱条件下进样测定，计算保留率，公式为保留率＝ （制粒后成分含量/制粒前成分含量） ×100%。

2.4.3 成型率测定 参考文献［5］ 报道，取颗粒适量（m1），称定能通过1 号筛但被5 号筛截留的颗粒质量（m2），计算成型率，公式为成型率＝ （m2/m1） ×100%

2.4.4 吸湿率测定 参考文献［6］ 报道，将恒重称量瓶放在盛有过饱和氯化钠溶液的干燥器中，置于25 ℃恒温箱中平衡24 h 后取出，精密称定质量（m1）； 精密称取颗粒适量（m2），平铺于称量瓶底部，放回25 ℃恒温箱中24 h后取出，称定质量（m3），计算吸湿率，公式为吸湿率＝［（m3-m1-m2） /m2］ ×100%。

2.4.5 休止角测定 采用固定漏斗法［7］。用铁架台将3 个串联漏斗固定，最下方漏斗与坐标纸的距离为H，从最上方漏斗缓慢倒入颗粒，当其形成的圆锥体顶尖与最下方漏斗顶尖发生接触时停止倾倒，底部半径为R，计算休止角，公式为休止角＝arctan （H/R）。

2.5 辅料筛选 以颗粒制备难易程度、溶化性、成型率为指标进行筛选，结果见表2，最终确定为甘露醇。

表2 辅料筛选结果

2.6 Plackett-Burman 试验 在湿法制粒过程中，影响颗粒成型的因素主要有药辅比、乙醇体积分数、乙醇用量、干燥时间、干燥温度［8-9］。本实验在前期单因素试验基础上进行Plackett-Burman 试验，分别采用AHP、CRITIC、AHPCRITIC 混合加权法对各指标进行综合评价，因素水平见表3，结果见表4。

表3 Plackett-Burman 试验因素水平

表4 Plackett-Burman 试验设计与结果

2.6.1 AHP 法 AHP 法属于主观赋权法［10-11］。本实验通过分析成分和3 个物理属性指标重要性，将各指标划分为4个层次，由层次划分结果构成两两比较优先判断矩阵，权重系数见表5，再按文献 ［12］ 报道计算一致性比率（CR），测得金丝桃苷、葛根素、橙皮苷转移率及成型率、吸湿率、休止角的权重系数分别为0.242 7、0.242 7、0.242 7、0.136 2、0.082 5、0.053 0，CR ＝0.010 9＜0.10，表明权重系数有效。

表5 各指标权重系数

2.6.2 CRITIC 法 CRITIC 作为客观赋权法［13-14］，是完全利用数据自身的客观属性进行科学评价［15］。本实验将表4数据进行无量纲化处理，金丝桃苷、葛根素、橙皮苷转移率及成型率均越大越好，吸湿率、休止角均越小越好，参考文献［16］ 报道计算权重，测得金丝桃苷、葛根素、橙皮苷转移率及成型率、吸湿率、休止角权重系数分别为0.161 9、0.117 6、0.129 7、0.230 4、0.236 6、0.123 8。

2.6.3 AHP-CRITIC 混合加权法 将AHP 法与CRITIC 法结合进行权重分配时，能兼顾主客观因素，使评分更科学，公式为ω综合ij＝ωAHPijωCRITICij/∑ωAHPijωCRITICij，测得金丝桃苷、葛根素、橙皮苷转移率及成型率、吸湿率、休止角的权重系数分别为0.256 3、0.186 0、0.205 1、0.204 5、0.066 5、0.081 6。

2.6.4 综合评分计算 结果见表6，可知3 种评分方法两两之间的相关系数均大于0.98 （P＜0.01），表明三者具有一致性； AHP 法、CRITIC 法所得权重相关系数为-0.620（P＞0.05），即反映的信息不具有叠加性，表明AHPCRITIC 混合加权法更全面。

表6 Plackett-Burman 试验综合评分计算结果（分）

2.6.5 方差分析 采用Minitab 19 软件对表4 数据进行处理，结果见表7。由此可知，模型P＜0.01，具有高度显著性； 辅料用量、润湿剂体积分数、干燥温度对综合评分具有显著影响（P＜0.05），故选择三者进行后续考察。同时，固定润湿剂用量为45%，干燥时间为120 min。

表7 Plackett-Burman 试验方差分析

2.7 Box-Behnken 响应面法 采用Design-Expert 10.0 软件，以辅料用量（A）、润湿剂体积分数（B）、干燥温度（C）为影响因素，各指标综合评分为评价指标，按-1、0、1 水平编码，结果见表8～9。由此可知，3 种评分方法两两之间的相关系数均大于0.98 （P＜0.01），表明三者具有一致性；AHP 法、CRITIC 法所得权重相关系数为-0.557 （P＞0.05），即反映的信息不具有叠加性，表明AHP-CRITIC 混合加权法更全面。

表8 Box-Behnken 响应面法设计与结果

表9 Box-Behnken 响应面法综合评分计算结果（分）

采用Design-Expert 10.0 软件对表8 数据进行二次多元回归拟合，方差分析见表10，可知模型P＜0.01，具有高度显著性； 相关系数R2＝0.953 3＞0.9，表明预测值与实测值的相关性较好，可用于分析； 各因素影响程度依次为B＞A＞C，并且均有极显著影响（P＜0.01）。响应面分析见图2，可知最优工艺为辅料用量0.31 倍，润湿剂（乙醇） 体积分数87.35%，干燥温度60 ℃，综合评分为98.61 分，考虑到在生产、实验中的便利性，将润湿剂体积分数修正为87%。

图2 各因素响应面图

表10 Box-Behnken 响应面法方差分析

按上述优化工艺进行3 批验证试验，测得平均综合评分为98.76 分，RSD 为0.12%，与预测值98.61 分接近，表明该工艺稳定可靠。

2.8 物理指纹图谱建立

2.8.1 物理指标选择及测定 结合文献［17-18］ 报道及颗粒剂物理性质、粉体学性质，选择堆积性、均一性、流动性、稳定性作为一级指标，松密度、振实密度、相对均齐度指数、豪斯纳比、休止角、干燥失重、吸湿性作为二级指标。参考文献［19］ 报道及相关标准收载，将15 批样品物理指标转换成0～10，取平均值，结果见表11。

表11 物理指纹图谱指标转化值测定结果

2.8.2 图谱生成及相似度分析 采用Excel 软件对15 批样品物理指标转化值进行处理，绘制雷达图，再对其平均值绘制雷达图，得到对照物理指纹图谱（SLS R），见图3。然后，采用SPSS 22.0 软件中的夹角余弦法进行相似度分析，发现各批样品之间的相似度均大于0.997，与对照物理指纹图谱的相似度均在0.999 以上，表明其稳定性良好。

图3 15 批视力舒颗粒物理指纹图谱

2.9 样品含量测定 取15 批样品，按“2.4.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.4.1.1” 项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表12。由此可知，各成分含量稳定，表明该工艺稳定可靠。

表12 各成分含量测定结果

3 讨论

视力舒颗粒制备工艺优化的过程遵循了质量源于设计（QbD） 理念［20］。本实验以3 种成分指标、3 个物理评价指标测得值的综合评分为关键质量属性，对5 个潜在工艺参数采用Plackett-Burman 试验进行筛选，再结合Box-Behnken响应面法进行优化。

在工艺优化的多指标决策中，权重具有重要地位，其合理性会直接影响排序准确性［21］。本实验考察了AHP 法、CRITIC 法、AHP-CRITIC 混合加权法，其中AHP 法依据成分指标与物理评价指标对颗粒质量影响的重要性，主观进行了层次划分； CRITIC 法是利用数据自身的客观属性进行科学评价，可消除人为因素，结果两者所得权重系数反映的信息不具有叠加性，故采用AHP-CRITIC 混合加权法，同时兼顾主客观因素，可使评分更科学合理。

颗粒物理属性是其质量评价的重要方面，可作为HPLC含量测定的补充，从而其全面质量控制提供了新思路，同时物理指纹图谱可对其物理性质进行全面反映［17］。本实验按优化工艺制备了15 批视力舒颗粒，建立了其物理指纹图谱，并采用HPLC 法对关键成分进行含量测定，发现各批样品质量具有较高的一致性，可为相关新药开发、工业化生产提供参考。根据实验结果，暂定视力舒颗粒质量控制标准为物理指纹图谱与对照物理指纹图谱的相似度应大于0.9，金丝桃苷、葛根素、陈皮苷含量分别应大于0.08%、0.48%、0.32%。