中华大蟾蜍皮化学成分及其细胞毒活性

孟令杰，孔庆宏，姜 念，吕慧婧，黎成锦，郭朝霞，刘 云，3*

（1.遵义医科大学，贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治重点实验室，贵州 遵义 563000； 2.遵义医科大学基础医学院，贵州 遵义 563000； 3.遵义医科大学法医学院，贵州 遵义 563000）

蟾蜍属动物有250 多种，分布于世界各地，我国有近10 种，主要有大蟾蜍华西亚种Bufobufo andrewsiSchmidt、大蟾蜍中华亚种Bufobufo gargarizansCantor 以及黑眶蟾蜍BufomelanostitusSchneider 三种［1］。其中，蟾皮为中华大蟾蜍和黑眶蟾蜍除去内脏的干燥皮，是临床常用中药，具有清热解毒、利水消肿的功效［2］。《本草纲目》 中记载蟾蜍皮主治恶疮、破症结、肿毒、肠头挺出和一切恶肿［3］。我国民间多用蟾皮治疗原发性肝癌、肺癌等，特别是以干蟾皮为原料制成的华蟾素注射液抗癌效果显著，例如给癌症晚期患者静脉滴注华蟾素注射液，在没有显著不良事件或疾病进展的情况下，40%患者病情平稳或显示出轻微的肿瘤体积收缩［4-5］。现代医药学研究表明，蟾皮具有抗肿瘤、强心等作用［6-8］，其化学成分主要包括蟾蜍甾烯类、生物碱类［9-14］。为进一步完善蟾皮的药效物质基础，本研究采用多种色谱学方法和波谱学技术对中华大蟾蜍皮95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位进行研究，从中发现1 个结构新颖且具有显著抗结肠癌活性的蟾蜍甾烯类化合物。

1 材料

Bruker AVANCE-500 MHz NMR 核磁共振波谱仪（德国Bruker 公司）； Agilent 1260/6120 液质联用-单四极杆质谱仪（美国Aglient 公司）； LCMSIT-TOF 质谱仪（日本岛津公司）； GX-281 全自动制备液相色谱（法国Gilson 公司）； 半制备HPLC色谱柱（10 mm×250 mm，5 μm，sunfire C18，美国Waters 公司）； 制备型HPLC 色谱柱［30 mm×150 mm，5 μm，XB-C8，月旭科技（上海） 股份有限公司］； 中压制备液相色谱系统 （瑞士Buchi 公司）； N1200 旋转蒸发仪 （日本EYELA 公司）；Sephadex LH-20 凝胶（美国GE 公司）； DLK-5010快速低温冷却循环机（宁波新芝生物科技股份有限公司）； SHZ-D （Ⅲ） 循环水式多用真空泵（河南予华仪器有限公司）； BS-100A 自动部分收集器（上海沪西电器有限公司）； SpectraMAX i3x 多功能酶标仪（美国Molecular Devices 公司）； 200 ～300目柱层析硅胶、GF254薄层板（青岛海洋化工有限公司）。中华大蟾蜍皮购自河北安国药材市场，经遵义医科大学宋长伟博士鉴定为中华大蟾蜍BufobufogargarizansCantor 的干燥皮。

人结肠癌细胞HCT-116、HT-29 （上海吉凯基因化学技术有限公司）； 五氟尿嘧啶（5-FU，上海麦克林生化科技股份有限公司）； 胎牛血清（以色列BI 公司）； PBS （北京索莱宝公司）； SRB、DMSO （美国Sigma 公司）。

2 提取与分离

取中华大蟾蜍皮20 kg 粉碎，95%乙醇20 L 加热回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，减压浓缩得浸膏1 kg，将浸膏加水混悬至5 000 mL，依次用石油醚、乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩后得石油醚部位（95 g） 和乙酸乙酯部位（220 g）。

取乙酸乙酯部位200 g，经硅胶柱分离，以石油醚-乙酸乙酯（1 ∶0 ～0 ∶1） 梯度洗脱，得到Fr.1～Fr.16。Fr.12 （26 g） 经ODS 柱分离，以甲醇-水（1 ∶1 ～1 ∶0） 梯度洗脱，得到Fr.12.1 ～Fr.12.6。Fr.12.3 （2.8 g） 经制备HPLC 纯化，以甲醇-水（3 ∶7 ～1 ∶0） 梯度洗脱 （体积流量8 mL/min，检测波长210 nm），得到Fr.12.3.1 ～Fr.12.3.6。Fr.12.3.2 （1.3 g） 经Sephadex LH-20柱分离，以二氯甲烷-甲醇 （1 ∶1） 洗脱，得到Fr.12.3.2.1～Fr.12.3.2.4。Fr.12.3.2.1 （18 mg）经半制备HPLC 纯化，以24% 乙腈洗脱（体积流量2.5 mL/min，检测波长210 nm），得到化合物1（3.7 mg，tR＝88 min）； Fr.12.3.2.4 （32 mg） 经反相半制备HPLC 纯化，以25% 乙腈洗脱（体积流量2 mL/min，检测波长210 nm），得到化合物5（0.7 mg，tR＝75 min）、4 （1.8 mg，tR＝80 min）。Fr.10 （14.8 g） 经Sephadex LH-20 柱分离，以甲醇洗脱，得到 Fr.10.1 ～ Fr.10.10。Fr.10.4（2.5 g） 经硅胶柱分离，以二氯甲烷-甲醇（1 ∶0～0 ∶1） 梯度洗脱，得到Fr.10.4.1 ～Fr.10.4.6。Fr.10.4.4 （1.1 g） 经ODS 柱分离，以甲醇-水（4 ∶6～1 ∶ 0） 梯度洗脱，得到Fr.10.4.4.1 ～Fr.10.4.4.6。Fr.10.4.4.1 （58 mg） 经制备HPLC纯化，以54%甲醇洗脱（体积流量5 mL/min，检测波长210 nm），得到化合物2 （1.9 mg，tR＝101 min）； Fr.10.4.4.3 经制备HPLC 纯化，以55%甲醇洗脱（体积流量5 mL/min，检测波长210 nm），得到化合物3 （1.9 mg，tR＝101 min）。

3 结构鉴定

化合物1： 白色无定型粉末，ESI-MSm/z：481 ［M+Na］+，939 ［2M+Na］+，HR-ESI-MSm/z：481.219 5 ［M+Na］+，分子式C26H34O7。［α］20D+10.8 （c1.0，CH3OH）； UV （CH3OH）λmaxlog 203 （3.47），212 （2.45），294 （2.75） nm；3 414，3 082，2 925，1 725，1 633，1 536，1 430，1 378，1 266，1 123，1 044，954，789，615 cm-1。1H-NMR、13C-NMR 谱显示结构中存在1个六元不饱和内酯环 ［δH7.36 （brs，H-21），8.01 （brd，J＝9.8 Hz，H-22），6.23 （d，J＝9.8 Hz，H-23）；δC118.3 （C-20），153.5 （C-21），150.8 （C-22），114.1 （C-23），164.0 （C-24）］；2 个角甲基 ［δH0.81 （s，H-18），δC17.4；δH0.91 （s，H-19），δC16.6］； 3 个连氧次甲基［δH3.93 （s，H-2），δC68.3；δH3.75 （d，J＝1.2 Hz，H-15），δC60.8；δH5.47 （dd，J＝9.4，1.2 Hz，H-16），δC76.5］； 2 个连氧季碳 ［δC75.6（C-5），73.5 （C-14）］； 1 个乙酰基 ［δH1.85（s，H-26），δC20.3 （C-26），171.6 （C-25）］。根据以上信息，结合前期从蟾皮中分离鉴定化合物的情况［15-18］，初步推断化合物1 具有蟾蜍甾烯母核。在HMBC 谱中，可观察到H-1 与C-2，H-2 与C-3，H-3 与C-5，H-19 与C-1、C-5 的相关信号，表明2 个羟基分别位于C-2、C-5 位； 同时，HMBC谱还显示H-8 与C-13、C-14，H-15 与C-14、C-17，H-18 与C-12、C-13、C-17 的相关信号，提示结构中存在14β，15β-环氧片段； 此外，H-16 与C-20、C-25，H-26 与C-25 的相关信号确定乙酰基片段位于C-16 位。综上所述，化合物1 的平面结构见图1。在NOESY 谱中，可观察到H-2 与H-4b，H-9与H-2，H-7b、H-17、H-7b 与H-15、H-16 的相关信号，提示上述质子均为α 构型； 同时可观察到H-8 与H-18、H-19 的相关信号，提示上述质子为β 构型。见表1、图2。确定化合物1 为 （2β，5β，14β，15β，16β） -2，15-二羟基-14，15-环氧-16-乙酰基-蟾蜍甾-20，22-二烯。

表1 化合物1 的1H-NMR、13C-NMR 数据Tab.1 1H-NMR and 13C-NMR datas of compound 1

图1 化合物1 的结构Fig.1 Structure of compound 1

图2 化合物1 的1H-1HCOSY、HMBC、NOESY 相关谱图Fig.2 1H-1HCOSY，HMBC，NOESY correlation spectra of compound 1

化合物2： 白色无定形粉末，ESI-MSm/z：403.3 ［M+H］+。1H-NMR （500 MHz，CD3OD）δ：7.98 （1H，dd，J＝9.7，2.6 Hz，H-22），7.41（1H，d，J＝2.6 Hz，H-21），6.27 （1H，d，J＝9.7 Hz，H-23），4.12 （ 1H，m，H-3），3.76（1H，m，H-3），2.53 （1H，dd，J＝9.5，6.0 Hz，H-17），1.07 （3H，s，19-CH3），0.70 （3H，s，18-CH3）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：164.8 （C-24），150.5 （C-21），149.3 （C-22），125.0 （C-20），115.4 （C-23），86.0 （C-14），74.8 （C-1），69.4 （C-3），52.2 （C-17），49.6（C-13），43.1 （C-8），41.7 （C-12），41.2 （C-10），38.7 （C-9），34.3 （C-4），33.1 （C-15），33.0 （C-2），31.8 （C-5），29.8 （C-16），27.4（C-6），22.5 （C-7），22.2 （C-11），19.4 （C-19），17.3 （C-18）。以上数据与文献［19］ 报道基本一致，故鉴定为1β-羟基蟾毒灵。

化合物3： 白色无定形粉末，ESI-MSm/z：401.3 ［M+H］+。1H-NMR （500 MHz，CD3OD）δ：9.58 （1H，m，H-19），8.02 （1H，dd，J＝9.6，2.6 Hz，H-22），7.45 （1H，d，J＝2.6 Hz，H-21），6.30 （1H，d，J＝9.6 Hz，H-23），4.11（1H，m，H-3），3.76 （1H，m，H-3），2.58（1H，dd，J＝9.5，6.5 Hz，H-17），0.70 （3H，s，18-CH3）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ：208.1 （C-19），164.8 （C-24），150.5 （C-21），149.4 （C-22），125.0 （C-20），115.4 （C-23），85.7 （C-14），66.5 （C-3），52.3 （C-17），52.1（C-10），49.7 （C-13），43.3 （C-8），41.8 （C-12），36.0 （C-9），33.2 （C-4），32.6 （C-15），30.4 （C-5），29.7 （C-16），29.3 （C-6），27.0（C-2），22.5 （C-7），22.2 （C-1），22.2 （C-11），17.1 （C-18）。以上数据与文献［20］ 报道基本一致，故鉴定为19-oxobufalin。

化合物4： 白色无定形粉末，ESI-MSm/z：413.3 ［M-H］-。1H-NMR （500 MHz，CD3OD）δ：7.95 （1H，dd，J＝9.6，2.6 Hz，H-22），7.59（1H，d，J＝2.6 Hz，H-21），6.30 （1H，d，J＝9.6 Hz，H-23），3.80 （1H，dd，J＝9.7，6.1 Hz，H-17），3.60 （1H，m，H-3），2.78 （1H，dd，J＝12.7，5.4 Hz，H-17），1.20 （3H，s，19-CH3），0.77 （3H，s，18-CH3）；13C-NMR （150 MHz，CD3OD）δ： 201.9 （ C-12），164.5 （ C-24），151.8 （C-21），149.1 （C-22），142.6 （C-11），132.9 （C-9），123.2 （C-20），115.7 （C-23），83.6 （C-14），71.6 （C-3），60.5 （C-13），45.2 （C-17），44.3 （C-5），42.5 （C-10），41.1（C-8），39.8 （C-4），39.2 （C-1），35.3 （C-2），34.0 （C-15），29.0 （C-16），28.7 （C-19），27.4（C-6），22.7 （C-7），16.7 （C-18）。以上数据与文献［8］ 报道基本一致，故鉴定为 （3α，5β，14β） -3，11，14-trihydroxy-12-oxo-bufa-9 （11），20，22-trienolide。

化合物5： 白色无定形粉末，ESI-MSm/z：423.1 ［M+Na］+。1H-NMR （500 MHz，CD3OD）δ：7.60 （1H，dd，J＝9.2，2.6 Hz，H-22），7.58（1H，brs，H-21），6.35 （1H，d，J＝9.2 Hz，H-23），4.96 （1H，m，H-16），4.10 （1H，m，H-3），2.55 （1H，d，J＝8.2 Hz，H-17），2.18（1H，d，J＝3.2 Hz，H-4a），2.15 （1H，m，H-6a），1.80 （1H，m，H-6b），1.50 （1H，m，H-4b），0.95 （3H，s，19-CH3），0.83 （3H，s，18-CH3）。以上数据与文献［11］ 报道基本一致，故鉴定为（3β，5β，16α） -3，5，16-trihydroxy-bufa-14，20，22-trienolide。

4 细胞毒活性评价

以五氟尿嘧啶（5-FU） 为阳性对照，取对数生长期的结肠癌细胞HCT-116、HT-29，以每孔8×103个的密度接种至96 孔板中，在5% CO2、37 ℃条件下培养24 h 后取出，分别加入含供试药物的培养液200 μL 继续培养24 h。培养结束后，加入预冷的10%TCA，4 ℃固定2 h，弃去TCA 固定液，用去离子水洗板5 次，甩尽多余的液体，室温晾干，每孔加入100 μL 0.4% SRB 染料，室温静置20 min，用0.1%醋酸溶液洗去未与细胞蛋白结合的SRB 染料，共5 次，室温晾干，每孔加入100 μL 10 mmol/L Tris 缓冲液，使其充分溶解。在酶联免疫检测仪上检测，计算IC50值，结果见表2。由此可知，化合物1～4 对HCT-116、HT-29 细胞具有增殖抑制作用（P＜0.05）。

表2 各化合物细胞毒活性比较（±s，n＝3）Tab.2 Comparison of cytotoxic effects of various compounds （±s，n＝3）

表2 各化合物细胞毒活性比较（±s，n＝3）Tab.2 Comparison of cytotoxic effects of various compounds （±s，n＝3）

注： 与5-FU 比较，＃P＜0.05。

化合物IC50/（μmol·L-1）HCT-116HT-29 1 2.67±2.14＃9.80±3.29＃2 0.08±0.03＃1.17±0.99＃3 0.36±0.07＃0.24±0.11＃4 2.11±0.10＃0.45±0.13＃5-FU32.23±26.1818.38±4.21

5 讨论

本研究从中华大蟾蜍皮中分离鉴定了1 个新的蟾蜍甾烯类化合物（化合物1） 以及4 个已知类似物（化合物2～5）。由于样品量所限，对化合物1～4 进行了初步的药效学评价，结果表明化合物1 ～4均对结肠癌HCT-116 和HT-29 细胞具有显著的增殖抑制作用，且效应强于5-FU。本研究结果进一步丰富了蟾蜍类药材化学成分的多样性，为构效关系的探讨提供了证据。同时，蟾皮化学成分丰富，其中的微量化学成分有待进一步研究。