脂肝清方对NAFLD 小鼠肝损伤及肝细胞凋亡的影响

徐文轩，宋汶轩，喇孝瑾，申明宇，王 硕，李 超，王秀萍，陈 震，齐亚娟，李继安*

（1.华北理工大学中医学院，河北省中西医结合防治糖尿病及其并发症重点实验室，河北 唐山 063200；2.华北理工大学基础医学院，河北 唐山 063200； 3.河北省农林科学院滨海农业研究所，河北 唐山 063210； 4.匈牙利东方国药集团，匈牙利 布达佩斯 999024）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD） 是最常见的慢性肝病之一［1］，可进展为肝硬化甚至肝细胞癌［2］。此外，NAFLD患者常伴有肥胖、糖尿病等，其心血管疾病和肝外癌症发生的风险也随之增加［3-4］。近年来，亚洲地区NAFLD 的患病率大幅上升［5］，已成为严重的公共卫生问题。以往研究者通过“二次打击” 理论来阐释NAFLD 的发病机制，即通过脂毒性的“一次打击” 后，继以胰岛素抵抗（insulin resistance，IR） 为基础，其他如氧化应激、细胞凋亡、炎症因子等多因素形成“第二次打击”，从而导致脂肪肝的发病［6］。当肝细胞脂肪变性发生时，大量游离脂肪酸可引起肝脏IR，同时激活内质网应激引发细胞损伤，Bcl-2 家族的抗凋亡蛋白（Bcl-2） 和促凋亡蛋白（Bax） 调节失衡，肝细胞无法维持结构和功能完整性，启动肝细胞凋亡［7-8］。因此，调节凋亡信号通路是防治NAFLD 肝细胞凋亡的主要机制之一。

现代中医认为NAFLD 属于“肥气” “肝痞”等范畴，根据临床分析，该病以脾虚肝郁、湿热蕴结、气滞血瘀为基础病机。基于此，课题组以枳术丸为基础，加清利湿热、活血化瘀中药拟定了脂肝清方。本研究以脂肝清方干预NAFLD 小鼠，观察小鼠肝组织病理形态学、肝细胞凋亡相关蛋白及mRNA 表达等，初步探索其作用机制。

1 材料

1.1 动物 48 只SPF 级C57BL/6J 雄性小鼠，8周龄，体质量18～22 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司 ［实验动物生产许可证号SCXK（京） 2020-0004］，饲养于华北理工大学实验动物中心屏障实验室，昼夜周期为12 h，温度20 ～22 ℃，相对湿度40% ～60%。动物实验方案经华北理工大学实验动物伦理委员会审查批准后实施（伦理号LX202090）。

1.2 药物 白术、枳实、茵陈、蒲公英、草决明、荷叶、姜黄、五味子、炒山楂（批号036210901、188211001、188211001、154211101、234210301、245211001、143220101、106210901、099210401）药材购自北京同仁堂药店唐山分公司，经李继安教授鉴定为正品。盐酸吡格列酮片 （国药准字H2010047） 购自江苏德源药业股份有限公司。

1.3 试剂 胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST） 检测试剂盒（江苏艾迪生生物科技有限公司，批号 20211211、20211211、G20211117S、G20211117S、G20211118S、G20211118S）； 小鼠C肽（C-Peptide）、胰岛素 （INS） ELISA 试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司，批号202110、202110）； 一步法TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光） （上海碧云天生物技术有限公司，批号C1088）； 兔源Bcl-2、caspase-3 多克隆抗体（英国Abcam 公司，批号GR224831-1、GR228406-3）；兔源Bax 多克隆抗体、小鼠源β-actin 单克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司，批号00094203、66009-l-lg）； 小鼠源tubulin alpha 1a （TUBA1A）单克隆抗体（武汉华美生物工程有限公司，批号10308）； 兔源cleaved caspase-3 多克隆抗体（美国Affinity Biosciences 公司，批号8354054）； 总RNA提取试剂盒（北京金沙生物科技有限公司，批号22RE70303）。

1.4 仪器 稳豪倍优型血糖仪（美国强生公司）；SpectraMaxM3 多功能微孔板读板机 （ 美国Molecular Devices 公司）； JY600E 型通用电泳仪电源及JY-SCZ2+型垂直电泳槽（北京君意东方电泳设备有限公司）； ChemiDoc XRS+型凝胶成像系统（美国伯乐公司）； BX53 型显微镜及SZX71 型荧光体式显微成像系统（日本奥林巴斯公司）； 荧光定量PCR 仪［耶拿分析仪器（北京） 有限公司］。

2 方法

2.1 药物制备 脂肝清方中白术、枳实、荷叶、茵陈蒸馏法提取挥发油，并用β-环糊精包合； 其药渣与草决明、蒲公英、炒山楂合并水提浓缩； 姜黄、五味子由75% 乙醇提取过滤，滤液回收乙醇并浓缩提取物，最后合并提取物，冷冻干燥备用，临用前使用蒸馏水溶解。药液经高效液相色谱检测，其主要含苍术酮0.038%、绿原酸0.053%、白术内酯I 0.076%。

2.2 造模、分组及给药 将48 只小鼠适应性喂养1 周，随机分为正常组 （8 只） 和造模组 （40只）。正常组小鼠给予普通饲料喂养，造模组小鼠给予60%高脂饲料［9］（北京华阜康生物科技股份有限公司，货号H10060，配方比例为脂肪60%、碳水化合物20%、蛋白质20%） 喂养。8 周后将造模组随机分为随机分为模型组、吡格列酮组（1.95 mg/kg） 和脂肝清方低、中、高剂量组（2.75、5.5、11 g/kg），每组8 只，灌胃给予相应剂量药物8 周，给药期间模型组及给药组继续给予60%高脂饲料喂养。

2.3 体质量、空腹血糖和口服葡萄糖耐量检测给药前及给药期间，每周测定1 次体质量，在给药第0、8 周进行口服葡萄糖耐量实验（oral glucose tolerance test，OGTT）。于OGTT 实验前禁食12 h，按2 g/kg 灌胃给予50% 葡萄糖注射液，检测0、30、60、90、120 min 血糖值，并采用Graphpad Prism 软件计算曲线下面积。

2.4 取材 给药结束后，小鼠麻醉并摘眼球取血，离心取血清，于-80 ℃冰箱中保存备用。取血后取肝脏，一半置于4%多聚甲醛中固定48 h，另一半于-80 ℃冰箱中保存备用。

2.5 血清生化指标检测及肝组织形态学观察 生化法检测小鼠血清TG、TC、HDL-C、LDL-C、AST、ALT、INS、C-Peptide 水平，并计算胰岛素抵抗指数（HOMA IR），公式为HOMA IR＝取材当天空腹血糖×空腹胰岛素/22.5。取于4%多聚甲醛中固定的小鼠肝组织，经过梯度乙醇脱水后石蜡包埋，制备4 μm 切片，分别行苏木素-伊红（HE）染色和PAS 染色，于显微镜下观察。每只小鼠随机选取一张切片，对其进行NAFLD 活动度评分（NAS），评分标准见表1［10］。

表1 NAS 评分标准Tab.1 NAS scoring standard

2.6 TUNEL 法检测小鼠肝组织细胞凋亡情况 取石蜡切片脱蜡水化，滴加蛋白酶K，室温孵育20 min，PBS 洗涤，滴加TUNEL 检测液，37 ℃避光孵育60 min，PBS 洗涤后DAPI 染核，封片后立即于荧光显微镜下观察，绿色荧光为凋亡细胞，蓝色荧光为细胞核。采用Image J 2.9.0 软件计算绿色荧光平均光密度值。

2.7 小鼠肝组织Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3 蛋白表达检测

2.7.1 免疫组织化学法 取石蜡切片常规脱蜡，每组随机选取3 张切片。将切片置于枸橼酸缓冲液中，微波加热进行抗原修复，冷却至室温后，滴加内源性过氧化物酶阻断剂封闭，滴加一抗Bax（1 ∶2 000）、Bcl-2 （1 ∶100） 4 ℃孵育过夜，滴加酶标羊抗小鼠/兔IgG 聚合物孵育，DAB 显色，Mayer 苏木素染核，脱水、透明、中性树胶封片，于显微镜下观察并拍照。采用Image J 2.9.0 软件分离染色图中的棕色通道，使用IHC Profiler 插件将阳性细胞的平均灰度值（染色强度） 和阳性面积百分比（染色面积） 共同作为测量指标。

2.7.2 蛋白免疫印迹法 取冻存的肝组织，加入RIPA 裂解液，振荡提取总蛋白，BCA 法测定各组样本蛋白浓度，加入蛋白示踪上样缓冲液，根据浓度加入相应体积的双蒸水，于恒温混匀仪100 ℃加热变性5 min。蛋白样本经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转至PVDF 膜，于快速封闭液中封闭2 h，TBST缓冲液洗涤，加一抗Bax （1 ∶5 000）、Bcl-2 （1 ∶100）、caspase-3 （1 ∶ 2 000）、cleaved caspase-3（1 ∶700）、tubulin （1 ∶25 000）、β-actin （1 ∶50 000） 4 ℃孵育过夜，加二抗（1 ∶9 000） 室温孵育，使用超敏ECL 发光液显影、曝光，通过Image Lab 6.1 软件测定各条带灰度值并记录。

2.8 小鼠肝组织Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表达检测 每组取出3 只肝组织，剪取60 mg 置于离心管中，滴加适量TRIzol 试剂后匀浆，抽提总RNA，加入氯仿混匀，高速离心后吸出上层无色液体与异丙醇混合，离心取沉淀，将沉淀与75%乙醇混匀，离心后弃去上清，加入DEPC 水溶解后冻存。采用M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA 试剂盒将总RNA 反转录为cDNA，加样后于PCR 仪进行进行定量PCR 反应。引物序列见表2。

表2 引物序列Tab.2 Primer Sequences

2.9 统计学分析 通过SPSS 26.0 软件进行处理，计量资料以（±s） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐时两两比较比较采用LSD 检验，若方差不齐时2 组间比较采用Tamhane's 检验； 不符合正态分布的数据采用非参数检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 脂肝清方对NAFLD 小鼠体质量的影响 造模8 周时造模组小鼠体质量较正常组升高。给药期间正常组小鼠体质量略有上升，模型组小鼠体质量大幅上升，吡格列酮组和脂肝清方各剂量组体质量逐渐下降。给药8 周时，模型组小鼠体质量高于正常组（P＜0.05）； 脂肝清方各剂量组小鼠体质量低于模型组（P＜0.05），趋近于正常组水平，见图1。

图1 各组小鼠体质量变化趋势Fig.1 Trend in mouse body mass change of each group

3.2 脂肝清方对NAFLD 小鼠空腹血糖值及OGTT曲线下面积的影响 给药干预前（第0 周），模型组和各给药组小鼠空腹血糖较正常组升高（P＜0.05）； 而模型组与各给药组之间无明显变化（P＞0.05）。给药8 周后，与模型组比较，吡格列酮组和脂肝清方各剂量组小鼠空腹血糖和OGTT 曲线下面积（OGTT AUC） 降低（P＜0.05，P＜0.01），见表3。

表3 各组小鼠空腹血糖值及OGTT AUC 比较（±s，n＝8）Tab.3 Comparison of mouse fasting blood glucose value and OGTT AUC in each group （±s，n＝8）

表3 各组小鼠空腹血糖值及OGTT AUC 比较（±s，n＝8）Tab.3 Comparison of mouse fasting blood glucose value and OGTT AUC in each group （±s，n＝8）

注： 与正常组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别第0 周空腹血糖/（mmol·L-1）第8 周空腹血糖/（mmol·L-1）第8 周OGTT AUC正常组3.55±0.323.53±0.2730.22±2.77模型组5.03±0.33**6.37±0.92**56.83±5.09**吡格列酮组5.20±0.13**4.42±0.33＃49.26±3.19＃＃脂肝清方低剂量组5.05±0.48**4.40±0.28＃49.97±5.01＃＃脂肝清方中剂量组4.92±0.62**4.07±0.19＃44.81±3.94＃＃脂肝清方高剂量组5.08±0.32**3.35±0.63＃＃41.68±3.32＃＃

3.3 脂肝清方对NAFLD 小鼠血清脂质和肝功能水平的影响 与正常组比较，模型组小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST 水平升高 （P＜0.01）； 与模型组比较，吡格列酮组和脂肝清方中、高剂量组小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），脂肝清方低剂量组小鼠TC、TG、LDL-C 水平降低（P＜0.01），见图2。

图2 各组小鼠血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、ALT、AST 水平比较（±s，n＝8）Fig.2 Comparison of mouse serum levels of TC，TG，HDL-C，LDL-C，ALT and AST in each group （±s，n＝8）

3.4 脂肝清方对NAFLD 小鼠血清C-Peptide、INS水平及IR 指数的影响 与正常组比较，模型组小鼠血清C-Peptide、INS 水平降低（P＜0.01），IR指数升高（P＜0.01）； 与模型组比较，吡格列酮组和脂肝清方各剂量组小鼠血清C-Peptide、INS 水平升高 （P＜0.05，P＜0.01），IR 指数降低 （P＜0.05，P＜0.01），见图3。

图3 各组小鼠血清C-Peptide、INS 水平及IR 指数比较（±s，n＝8）Fig.3 Comparison of mouse serum levels of INS，C-Peptide and IR index in each group （±s，n＝8）

3.5 脂肝清方对NAFLD 小鼠肝组织病理形态的影响 正常组肝组织细胞排列致密，大小均匀，结构完整，细胞质分布均匀且清晰，细胞核位于细胞质的中心； 模型组肝组织出现大范围脂肪变性及脂滴堆积，细胞质受到脂滴的占位挤压，排列疏松，呈渔网状分布，同时可见大量炎性细胞浸润； 吡格列酮组和脂肝清方各剂量组肝组织脂肪变性有不同程度改善，炎性浸润减少，见图4。各组小鼠肝组织NAS 评分如表4 所示，与正常组比较，模型组小鼠肝组织NAS 评分升高（P＜0.01）； 与模型组比较，吡格列酮组和脂肝清方各剂量组小鼠肝组织NAS评分均降低（P＜0.01）。

图4 各组小鼠肝组织HE 染色（×200）Fig.4 HE staining of mouse liver tissue in each group（×200）

表4 各组小鼠肝组织NAS 评分比较（±s，n＝8）Tab.4 Comparison of NAS scores in mouse liver tissue of each group （±s，n＝8）

表4 各组小鼠肝组织NAS 评分比较（±s，n＝8）Tab.4 Comparison of NAS scores in mouse liver tissue of each group （±s，n＝8）

注： 与正常组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃＃P＜0.01。

组别NAS 评分/分正常组0.00±0.00模型组4.13±0.64**吡格列酮组1.88±0.99＃＃脂肝清方低剂量组2.25±0.46＃＃脂肝清方中剂量组1.87±0.83＃＃脂肝清方高剂量组1.50±0.53＃＃

3.6 脂肝清方对NAFLD 小鼠肝组织糖原分布的影响 正常组肝组织糖原阳性物质呈紫红色，细胞核呈蓝色，糖原分布饱满且均匀； 模型组肝细胞排列紊乱，出现大量脂肪空泡，PAS 糖原阳性反应较弱，糖原分布稀薄且不均匀，镜下呈粉红色； 吡格列酮组和脂肝清方各剂量组脂肪空泡减少，PAS染色相对饱满且均匀，见图5。

图5 各组小鼠肝组织糖原分布（PAS 染色，×200）Fig.5 Distribution of glycogen in mouse liver tissue of each group （PAS staining，×200）

3.7 脂肝清方对NAFLD 小鼠肝组织细胞凋亡的影响 正常组肝组织中鲜见凋亡细胞（TUNEL 绿色荧光阳性细胞）； 与正常组比较，模型组TUNEL阳性表达增加（P＜0.01），即凋亡细胞数量增加；与模型组比较，吡格列酮组和脂肝清方各剂量组TUNEL 阳性表达降低（P＜0.01），即凋亡细胞数量减少，见图6。

图6 各组小鼠肝组织细胞凋亡情况（TUNEL 染色，×200，±s，n＝6）Fig.6 Apoptosis in mouse liver tissue of each group （TUNEL staining，×200，±s，n＝6）

3.8 脂肝清方对NAFLD 小鼠肝组织Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表达的影响

3.8.1 免疫组化实验 与正常组比较，模型组小鼠肝组织Bax 蛋白表达升高（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表达降低（P＜0.01）； 与模型组比较，吡格列酮组和脂肝清方中、高剂量组小鼠肝组织Bax 蛋白表达降低 （P＜0.01），Bcl-2 蛋白表达升高 （P＜0.05，P＜0.01），脂肝清方低剂量组小鼠肝组织Bax 蛋白表达降低（P＜0.01），见图7。

图7 各组小鼠肝组织Bax、Bcl-2 蛋白免疫组化染色（×200，±s，n＝3）Fig.7 Immunohistochemical staining of Bax and Bcl-2 protein in mouse liver tissue of each group （×200，±s，n＝3）

3.8.2 Western blot 实验 与正常组比较，模型组小鼠肝组织Bcl-2 蛋白表达降低（P＜0.01），Bax、caspase-3、cleaved caspase-3 蛋白表达和Bax/Bcl-2比值升高（P＜0.01）； 与模型组比较，吡格列酮组和脂肝清方各剂量组小鼠肝组织Bcl-2 蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01），Bax、cleaved caspase-3 蛋白表达和Bax/Bcl-2 比值降低（P＜0.01），吡格列酮组和脂肝清方中、高剂量组小鼠肝组织caspase-3 蛋白表达降低（P＜0.01），见图8、表5。

图8 各组小鼠肝组织Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3 蛋白条带图Fig.8 Protein bands of Bax，Bcl-2，caspase-3 and cleved caspase-3 in mouse liver tissue of each group

表5 各组小鼠肝组织Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3、Bax/Bcl-2 蛋白表达比较（±s，n＝3）Tab.5 Comparison of Bax，Bcl-2，caspase-3 and cleaved caspase-3 protein expressions in mouse liver tissue of each group（±s，n＝3）

表5 各组小鼠肝组织Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved caspase-3、Bax/Bcl-2 蛋白表达比较（±s，n＝3）Tab.5 Comparison of Bax，Bcl-2，caspase-3 and cleaved caspase-3 protein expressions in mouse liver tissue of each group（±s，n＝3）

注： 与正常组比较，**P＜0.01； 与模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

组别Bax/tubulinBcl-2/tubulincaspase-3/tubulincleaved caspase-3/β-actinBax/Bcl-2正常组0.22±0.020.32±0.020.33±0.014.21±0.140.69±0.04模型组0.51±0.04**0.19±0.05**0.42±0.05**6.57±0.24**2.80±0.48**吡格列酮组0.29±0.03＃＃0.25±0.01＃0.34±0.01＃＃5.14±0.20＃＃1.19±0.18＃＃脂肝清方低剂量组0.34±0.06＃＃0.27±0.05＃＃0.39±0.015.70±0.21＃＃1.26±0.12＃＃脂肝清方中剂量组0.33±0.08＃＃0.26±0.003＃0.35±0.04＃＃5.47±0.14＃＃1.27±0.28＃＃脂肝清方高剂量组0.27±0.02＃＃0.27±0.05＃＃0.31±0.02＃＃4.93±0.13＃＃0.99±0.07＃＃

3.9 脂肝清方对NAFLD 小鼠肝组织Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表达的影响 与正常组比较，模型组小鼠肝组织Bcl-2 mRNA 表达降低（P＜0.01），Bax、caspase-3 mRNA 表达升高 （P＜0.05，P＜0.01）； 与模型组比较，吡格列酮组和脂肝清方高剂量组Bcl-2 mRNA 表达升高 （P＜0.05），Bax、caspase-3 mRNA 表达降低 （P＜0.05，P＜0.01），脂肝清方中剂量组BaxmRNA 表达降低 （P＜0.05），见图9。

图9 各组小鼠肝组织Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA 表达比较（±s，n＝3）Fig.9 Comparison of mRNA expressions of Bax，Bcl-2 and caspase-3 in mouse liver tissue of each group （±s，n＝3）

4 讨论

NAFLD 以肝脏脂肪变性等为主要特征，一般认为脂质过度堆积会促进IR，IR 可导致脂肪肝发生，而脂肪肝又可加重IR［11］，从而加剧脂毒性，引起肝细胞凋亡，促进脂质的堆积，加重NAFLD的病理损害，形成恶性循环［12-13］。

半胱氨酸蛋白酶-3 （caspase-3） 为细胞凋亡级联反应通路的核心蛋白。研究证明NAFLD 模型的caspase-3 激活和肝细胞凋亡与疾病严重程度相关［14］。另外，Bcl-2 家族通过影响线粒体膜的通透性来调控凋亡。抗凋亡蛋白Bcl-2 和Bcl-xL 定位于线粒体外膜，抑制细胞色素C 的释放； 促凋亡蛋白Bax 定位于胞浆，在收到凋亡信号后，转移到线粒体中促进细胞色素C 的释放，Bax 过表达可促进细胞凋亡； 而Bcl-2 可与Bax 形成二聚体，抑制Bax 的表达，从而抑制细胞凋亡［15］。调节Bcl-2 家族相关蛋白表达是治疗NAFLD 潜在靶向，对药物研究具有重要意义。

本实验结果显示，模型组小鼠血脂、肝功能指标及HOMA IR 指数升高，INS 和C 肽水平均降低。值得注意的是，模型组小鼠HDL-C 水平出现了异常升高。研究发现，HDL-C 其与心血管疾病、2 型糖尿病等疾病呈“U” 型曲线相关［16］，过高水平的HDL-C 会增加死亡风险，出现这一现象可能是过高水平的HDL-C 可促进炎症、增加氧化应激有关［17］。本研究病理结果显示，模型小鼠肝细胞大范围脂肪变性，存在明显的炎性细胞浸润，凋亡细胞数量增加。上述结果提示NAFLD 小鼠存在糖脂代谢紊乱、IR、肝细胞凋亡、脂肪肝和肝组织受损。

脂肝清方中白术、枳实具健脾理气散结之效，为主药； 茵陈、草决明、蒲公英具清利湿热、利尿散结之效，姜黄具行气破瘀之效，焦山楂具消食散瘀之效，荷叶具健脾升清之效，为臣药； 五味子具收敛固涩、益气生津、护肝之效，为佐使药。现代药理学研究发现，白术多糖可调节肠道菌群，减轻肝脏炎症，下调Bax 蛋白表达，上调Bcl-2 蛋白表达，抑制凋亡进而缓解NAFLD 的进展［18］； 枳实可调节肝脏脂代谢紊乱，并有降血糖、肝脏保护作用［19］； 姜黄素通过调节P5 调控caspase-3、Bax、caspase-9、Bcl-2 与线粒体途径相关的细胞色素C分子表达，抑制肝细胞凋亡［20］； 五味子和荷叶具有抗凋亡、抗脂质过氧化作用，对NAFLD 大鼠肝细胞具有保护作用［21-22］。全方具有调节糖脂代谢、抑制肝细胞凋亡、抗炎及改善肝损伤作用。本实验结果显示，脂肝清方可降低模型小鼠体质量、血脂及肝功能指标，改善胰岛素抵抗，改善肝脂肪变性、炎性浸润及糖原储存，减少细胞凋亡，下调Bax、caspase-3 及cleaved caspase-3 蛋白表达，上调Bcl-2 蛋白表达，提示脂肝清方可调控细胞凋亡相关蛋白进而保护肝细胞受损。

综上所述，脂肝清方可调节NAFLD 小鼠糖脂代谢，改善胰岛素抵抗，抑制肝细胞凋亡，从而减轻NAFLD 肝损伤，其作用机制可能与调控Bcl-2、Bax、caspase-3 凋亡蛋白表达，抑制肝细胞凋亡有关。