肿瘤浸润淋巴细胞数量、微卫星不稳定性与大肠癌分期的相关性及对预后的评估价值分析

张翼臻 裴大兵

大肠癌是结直肠癌的统称,临床较常见,发病年龄趋于老年化,且男性患者多发。大肠癌患者早期一般无明显症状,一般只有消化不良、大便潜血等轻微症状,但是随着病情发展,患者会出现肠梗阻、发热消瘦等较为明显的全身症状［1］,所以,寻找判断大肠癌分期和预后的指标,尽早制定治疗方案对预后有积极意义。TILs 与癌细胞的生长、浸润和转移密切相关,是肿瘤环境参数,可反映大肠癌侵袭能力和预后［2］。MSI是指肿瘤中DNA 发生错配修复而导致的缺陷［3］,是肿瘤免疫治疗的重要生物标志物之一,其检测近年来备受关注。故本研究主要对TILs 数量、MSI 与大肠癌分期及预后的相关性进行分析,旨在为临床治疗提供指导作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018 年1 月～2020 年1 月本院收治的98 例大肠癌患者,纳入标准：①符合大肠癌诊断标准［4］；②临床资料完整,患者或家属知情同意。排除标准：①处于妊娠/哺乳期者；②合并其他肿瘤者［5］；③有精神疾病者；④近1 个月内接受过放化疗者。98 例大肠癌患者年龄26～78 岁,平均年龄(57.83±11.23)岁；男52 例,女46 例；其中原发肿瘤位于结肠45 例,位于直肠53 例；大肠癌分期：Ⅰ期20 例,Ⅱ期38 例,Ⅲ期21 例,Ⅳ期19 例。根据肿瘤分期将Ⅰ期和Ⅱ期设为早期组(58 例),Ⅲ期和Ⅳ期设为晚期组(40 例)。早期组患者年龄27～75 岁,平均年龄(57.45±11.24)岁；男31 例,女27 例。晚期组患者年龄26～78 岁,平均年龄(58.29±11.37)岁；男21 例,女19 例。早期组和晚期组一般资料比较差异无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。将患者根据生存情况分为存活组(82 例)和死亡组(16 例)。

1.2 检测方法 TILs 检测：采用免疫组织化学法检测,将患者肿瘤标本使用甲醛溶液固定,用常规石蜡包埋,将标本连续切片(3 μm)后制片,进行检测。主要流程为二甲苯溶液脱蜡、水化后水洗,进行抗原修复后孵育冲洗。滴加稀释的免疫组化染色液,观察出现终止反应后冲洗、复染,通过盐酸酒精分化,水洗、冲洗、漂洗后以中性树胶封片。CD4+和CD8+为细胞膜着色,通过显微镜选择5 个具有代表性区域在×400 视野下计算CD4+和 CD8+T 淋巴细胞数量,求平均值。微卫星状态：采用聚合酶链式反应检测MSI,通过比较肿瘤细胞和正常细胞中核苷酸重复序列的长度来检测,通过聚合酶链式反应扩增选择性微卫星以及在自动测序仪上通过毛细管电泳分析片段大小来识别,分为MSI 高(MSI-H,≥30%标记物不稳定)、MSI 低(MSI-L,＜30%标记物不稳定)和微卫星稳定(MSS,无标记物不稳定)3 种类型。

1.3 治疗方法 两组患者均进行化疗,根据相关诊疗指南［6］制定患者的化疗方案,包括卡培他滨片(江苏恒瑞医药股份有限公司,国药准字H20133365)1250 mg/m2,分早晚两次饭后30 min 口服,患者服药2 周后停药1 周；奥沙利铂(深圳海王药业有限公司,国药准字H20031048)按照患者体表面积130 mg/m2给药,加入5%葡萄糖溶液250～500 ml 中静脉滴注2～6 h,每3 周给药1 次。同时给予常规护理干预,严密监测患者生命体征,并给予抗生素以防感染。

1.4 观察指标 比较早期组和晚期组TILs 数量和微卫星状态(表达阴性数量),分析TILs 数量和微卫星状态与大肠癌分期的相关性。对患者进行随访,自患者入组之日开始随访,随访截止时间为2023 年1 月,比较存活组和死亡组TILs 数量和微卫星状态(表达阴性数量),分析TILs 数量和微卫星状态对大肠癌预后的评估价值。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差 ()表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验；TILs 数量和微卫星状态与大肠癌分期的相关性采用Pearson 相关分析,TILs 数量和微卫星状态在大肠癌患者预后评估中的价值采用ROC 曲线评估。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 早期组和晚期组患者TILs 数量和微卫星状态比较 早期组患者CD4+和CD8+T 淋巴细胞数量及微卫星表达阴性数量均高于晚期组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 早期组和晚期组大肠癌TILs 数量和微卫星状态比较()

表1 早期组和晚期组大肠癌TILs 数量和微卫星状态比较()

注：与晚期组比较,aP＜0.05

2.2 TILs 数量和微卫星状态与大肠癌分期的相关性分析 Pearson 相关性分析显示：大肠癌分期与CD4+和CD8+T 淋巴细胞数量及微卫星表达阴性数量呈负相关(r=-0.451、-0.447,-0.487,P＜0.05)。

2.3 存活组和死亡组患者TILs 数量和微卫星状态比较 存活组患者CD4+和CD8+T 淋巴细胞数量及微卫星表达阴性数量均高于死亡组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 存活组和死亡组患者TILs 数量和微卫星状态比较()

表2 存活组和死亡组患者TILs 数量和微卫星状态比较()

注：与死亡组比较,aP＜0.05

2.4 TILs 数量和微卫星状态与大肠癌预后的ROC 分析 ROC 结果显示,CD4+和CD8+T 淋巴细胞数量和微卫星表达阴性数量诊断大肠癌预后的AUC 分别为0.765、0.741 和0.730,此时各水平的截断值分别为60.240%、9.157%和1.940 个(P＜0.05)。见图1,表3。

图1 TILs 数量和微卫星状态与大肠癌患者预后的ROC 曲线图

表3 TILs 数量和微卫星状态对大肠癌患者预后的ROC 曲线分析

3 讨论

流行病学研究显示,2020 年全球新发近200 万大肠癌患者,发病率居于恶性肿瘤第3 位,另外生存率较低,5 年内死亡率高达50%,占第2 位［7］,目前临床主要执行以手术切除为主的综合治疗方案,但是制定手术综合治疗方案前需要明确患者的具体情况,对其治疗效果和预后具有重要意义。TILs 是肿瘤特异性免疫反应的一种产物［8］,微卫星状态检测已成为大肠癌患者诊疗的常规检查项目［9］。有研究显示,MSI 临床检测对患者病情筛查、治疗方案的制定有重要意义［10］。近年来,人们逐渐重视在控制肿瘤进展中宿主免疫系统的重要性,并将新的免疫生物标记物作为其治疗效果和预后的预测工具。本次研究结果显示,Pearson 相关性分析显示：大肠癌分期与CD4+和CD8+T 淋巴细胞数量及微卫星表达阴性数量呈负相关(r=-0.451、-0.447,-0.487,P＜0.05)。由此提示与MSS 相比,MSI-H的大肠癌患者具有更好的预后,其预后的改善可能与宿主抗肿瘤免疫反应更明显相关。事实上,淋巴细胞浸润在MSI 大肠癌患者中也很突出,这是由于错配修复蛋白系统的缺失以及随之产生的帧移突变的积累导致氨基酸序列改变的多肽(新抗原)的转录和翻译,新抗原由人类白细胞抗原Ⅰ(HLAⅠ)类呈现并被细胞毒性T 细胞识别［11］。病情发展不良的大肠癌患者一般免疫功能较差,CD8+T 细胞浸润多发生在癌症早期,随着病程的进展会不断变少,说明这些细胞可以限制肿瘤细胞浸润生长［12,13］。

本次研究结果显示,早期组患者CD4+和CD8+T 淋巴细胞数量及微卫星表达阴性数量均高于晚期组,差异有统计学意义(P＜0.05)。存活组患者CD4+和CD8+T 淋巴细胞数量及微卫星表达阴性数量均高于死亡组,差异有统计学意义(P＜0.05)。由此说明微卫星不稳定患者的预后情况明显优于微卫星稳定患者,且患者的病情会随着微卫星高频数量的减少而加重。相关研究显示［14,15］,MSI 是筛查大肠癌的重要工具,是患者化疗和免疫治疗效果和预后结局的重要标志物,其中MSI-H 肿瘤多发生于右半结肠,具有密集的免疫浸润,与肿瘤发生具有密切的相关性。MSI-H 患者淋巴结远处转移几率均较低,微卫星不稳定患者的预后较好,淋巴结转移和远处转移较少。

综上所述,大肠癌患者的TILs 数量和MSI 会随着患者的病情加重而减少,且这两种指标对大肠癌患者的预后有一定的评估效能,可以为临床治疗提供指导作用。