不同来源硒对山羊血液及睾丸抗氧化酶活性的影响

杨茹洁

（1.山西省畜牧兽医学校，山西太原 030024；2.山西农业大学，山西晋中 030801）

谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）是生物体内重要的含硒酶，是生物体内抗氧化防御体系的重要组成之一，能够有效的清除体内新陈代谢所产生的氧自由基，防止生物大分子发生氧化应激反应，保护细胞膜的结构和功能，维持组织内的氧代谢平衡。分子生物学和遗传学的研究表明，GSH-Px 活性降低，可以导致组织细胞抗氧化损伤能力减弱，直接影响细胞的分裂、繁殖、遗传及生长，进而干扰核酸、蛋白质、粘多糖及酶的合成及代谢，引发多种疾病[1]。GSH-Px 还能防止精子在生长过程中的突变。GSH-Px 也是反映机体硒水平的重要指标。胡彩虹[2]报道，添加0.01～0.30μmol/L 的不同水平的蛋氨酸硒和纳米硒（以硒计），能显著提高鸡肝细胞中GSH-Px 的活性。姚元枝等[3]报道日粮添加硒0.1～0.3mg/kg 时，能显著提高全血中GSH-Px 活性。关于硒对山羊GSH-Px 的活性影响的报道甚少。

因此，本试验通过在羊日粮中添加蛋氨酸硒和纳米硒，研究不同来源硒对波尔山羊公羔血液及组织器官内抗氧化酶活性的影响，以期在实际生产上为应用硒提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

纳米硒：上海四通纳米科技有限公司，浓度184mg/kg，粒径20～60nm，平均粒径36nm。

蛋氨酸硒（美特硒）：浙江建德维丰饲料有限公司馈赠，浓度1500mg/kg，分子式：C20H43N4O8S4Se，分子量675。

1.2 试验设计和饲养管理

本试验选用山西太行山腹地贫硒地区黎城种羊场80 只体重相近、体格健壮的种用2 月龄断奶的波尔山羊公羔。公羔随机分为5 组，每组16只羊。预试2 周，正试16 周，分别饲喂基础日粮（对照组）；基础日粮+0.1mg/kg 蛋氨酸硒（蛋氨酸硒I 组）；基础日粮+0.3mg/kg 蛋氨酸硒（蛋氨酸硒II 组）；基础日粮+0.1mg/kg 纳米硒（纳米硒I 组）；基础日粮+0.3mg/kg 纳米硒（纳米硒II 组），添加量以硒浓度计算。基础日粮组成及营养水平见表1。试验羊只进行驱虫和常规免疫。各组供试公羔采用舍饲高架饲养，在整个试验期每日每只公羔定量供给700g 饲料，实际干物质量580g，分别在早7:00 和晚19:00 分两次等量饲喂，精料在饲喂干草前30min 饲喂，自由饮水。

表1 基础日粮配方与主要营养成分

1.3 样品采集

每个试验组每隔4 周随机选取3 只公羔颈静脉采血10mL，加肝素钠抗凝，冷冻于-20℃，另取5mL 血 液37℃水 浴1h，3000r/min 离 心15min，分离血清保存于离心管中，-20℃保存待测。每个试验处理每隔4 周随机去势3 只公羔，取出双侧睾丸用生理盐水冲洗3～5 次，去除血渍及脂肪，剥离表面白膜及附睾，迅速将左侧睾丸切块后置于-70℃冰箱保存备用。

1.4 检测的项目及方法

1.4.1 全血、血清、睾丸组织中GSH-Px 活性的测定

谷胱甘肽过氧化物酶活性测定采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，GSH-Px 的测定测定原理为：GSH-Px 可以促进过氧化氢与还原型谷胱甘肽反应生成H2O 及氧化型谷胱甘肽，GSH-Px的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定其酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。由于反应物在没有GSH-Px 的条件下也能进行非酶促的氧化还原反应，因此在实验中设定了非酶管的反应，在计算酶活力时用来扣除非酶促反应所引起的GSH 减少的部分。根据试剂盒说明书配制试剂，进行酶管与非酶管的酶促反应与显色反应，最后用UV-2100 型紫外-可见分光光度计在412nm 处测定各管的OD 值。根据说明书提供的方法来计算GSH-Px 活力，见式（1）：

1.4.2 血清中超氧化物歧化酶及丙二醛的检测

采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的测定测定原理为：通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子（O2-），后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计测定其吸光度。当被测样品中含SOD 时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可以求出被测样品中的SOD 活力。根据试剂盒说明书配制试剂并进行反应，最后用分光光度计在5nm 处测定各管的OD 值。根据说明书提供的方法来计算SOD 活力，见式（2）：

丙二醛（Malonic aldehyde，MDA）含量的测定方法为TAB 法，即过氧化脂质降解产物中的丙二醛可与硫代巴比妥酸缩合，形成红色产物，在2nm 处有最大吸收峰。按照试剂盒说明书提供的方法进行操作，分别设定标准管，标准空白和测定空白管，用分光光度计在2nm 处测定各管吸光度值。根据式（3）计算MDA 含量：

1.4.3 睾丸组织匀浆液的制备

将待测的睾丸组织在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，用滤纸拭干。准确称量后，置于玻璃匀浆管内。量取9 倍于组织重的预冷的生理盐水，将其2/3 倒入匀浆管内，放入捣杆，用电动匀浆机搅拌，使组织完全破碎。将匀浆液转入离心管内，用剩余生理盐水反复冲洗匀浆管内壁和捣杆，冲洗液也倒入离心管内，制成10%的睾丸组织匀浆液。将匀浆液以3000r/min 离心10min，取上清液，4℃冷藏备用。以上整个匀浆操作过程在4℃下进行。取适量10%的睾丸组织匀浆液，按照试剂盒说明书的要求，在测定前进行预实验，后根据预实验结果对匀浆液进行不同浓度稀释后，测定GSH-Px 的活力。

1.5 主要仪器与设备

数显电热恒温水浴箱购自于北京市长风仪器仪表公司，UV-2100 型分光光度计购自于尤尼卡（上海）仪器有限公司，电动匀浆机购自于德国IKA，低温冷冻离心机购自于Beckman 公司，Y96000 型电子分析天平购自于上海精密仪器公司。

1.6 统计分析

试验数据使用Excel XP 进行初步处理。SPSS 10.0 进行ANOVA 统计处理，并用Dunnett 法进行多重比较，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同水平的蛋氨酸硒和纳米硒对波尔山羊公羔全血、血清、睾丸中GSH-Px 活性的影响

由表2 可知，随着日龄的增长，羔羊全血中GSH-Px 的活性明显升高。纳米硒II 组GSH-Px活性在不同试验阶段均显著高于对照组（P＜0.05），但相同浓度的不同硒源之间差异不显著（P＞0.05）。蛋氨酸硒II 组和纳米硒II 组在补硒4周后，GSH-Px 的活性迅速上升，在第12 周时达到高峰。而蛋氨酸硒I 组和纳米硒I 组GSH-Px的活力则是平稳上升，在第16 周达到高峰，高峰值略低于蛋氨酸硒II 组和纳米硒II 组。

表2 不同水平的蛋氨酸硒和纳米硒对波尔山羊公羔GSH-Px 活性的影响

纳米硒II 组血清GSH-Px 的活性均显著高于对照组（P＜0.05），但与蛋氨酸硒II 组差异不显著（P＞0.05）。日粮添加不同饲料硒源后较对照组显著提高了血清GSH-Px 的活性，但相同浓度的不同硒源之间差异不显著（P＞0.05）。

随着日龄的增长，羔羊睾丸中GSH-Px 的活性明显升高。试验组GSH-Px 的活性在整个试验期内均显著高于对照组（P＜0.05）。日粮添加不同饲料硒源后较对照组显著提高了GSH-Px 的活性，但相同浓度的不同硒源之间差异不显著（P＞0.05）。在试验前期蛋氨酸硒II 组和纳米硒II组对睾丸GSH-Px 的影响效果好于蛋氨酸硒I 组和纳米硒I 组，但随着补硒时间的延长，各试验组GSH-Px 的活性基本一致。

试验组羔羊肝脏中的GSH-Px 的活性显著高于对照组（P＜0.05），在第16 周时蛋氨酸硒I 组和纳米硒I 组的GSH-Px 活性基本一致，稍高于蛋氨酸硒II 组和纳米硒II 组，对照组GSH-Px 活性最低。

2.2 不同水平的蛋氨酸硒和纳米硒对波尔山羊公 羔血清中SOD 活性、MDA 含量的影响

由表3 可知，随着日龄的增长，羔羊血清中SOD 的活性明显升高。试验组SOD 的活性在整个试验期内均显著高于对照组（P＜0.05）。日粮添加不同饲料硒源后较对照组显著提高了SOD 活性（P＜0.05），但相同浓度的不同硒源之间差异不显著（P＞0.05）。在试验结束时，各试验组之间差异不显著（P＞0.05）。蛋氨酸硒II 组和纳米硒II 组SOD 的活性在第12 周时达到高峰，第16周时不再升高。蛋氨酸硒I 组和纳米硒I 组在第12 周时增幅较大，在第16 周时稍有增长。对照组在整个试验期SOD 活性平稳增长，但增长速度缓慢。

表3 不同水平的蛋氨酸硒和纳米硒对波尔山羊公羔血清中SOD 活性和MDA 含量的影响

试验组MDA 的含量在整个试验期内均显著低于对照组（P＜0.05）。日粮添加不同饲料硒源后较对照组显著降低了MDA 的含量，但相同浓度的不同硒源之间差异不显著（P＞0.05）。在试验结束时，对照组血清MDA 含量最高，蛋氨酸硒II 组和纳米硒II 组次之，蛋氨酸硒I 组和纳米硒I 组最低。

3 讨论

3.1 不同水平的蛋氨酸硒和纳米硒对波尔山羊公羔体内GSH-Px 活性的影响

自由基是指能独立存在的，含一个或一个以上不配对电子的原子、原子团、分子或离子。它是在有氧呼吸过程中由于O2-的连续单电子还原而产生的一系列有毒的中间产物。自由基对机体健康有着双重作用：一方面，自由基对正常生命活动的许多重要反应必不可少，它参与生物活性物质的合成、解毒反应以及吞噬细胞、参与动植物胚胎发育等；另一方面，过量自由基侵袭构成细胞膜的脂质及蛋白质，产生各种不安定的自由基，给机体造成损害，成为各种疾病的病因及增恶因子，对机体危害很大。过量自由基的清除依赖于SOD、GSH-Px 和过氧化氢酶等的协同作用才能完成。GSH-Px 是生物体内重要的含硒酶，其活性和表达都受到生物体内硒含量与硒状态的调节，缺硒会造成GSH-Px 活性降低，导致组织细胞抗氧化损伤能力减弱。有研究表明，缺硒可以引发脂质过氧化反应，导致蛋白质、核酸等生物大分子物质损伤，影响机体内环境的相对稳定。当摄入硒的剂量为营养剂量时，含硒酶活力随剂量的增加而增加，而当摄入硒剂量为超营养剂量时，含硒酶的活力升高到一定程度后就不再升高，维持在一个高水平的平台上，即含硒酶的活力达到饱和。

本试验结果表明不同水平的蛋氨酸硒和纳米硒两种有机硒化合物都能有效地提高公羔血液、睾丸及肝脏中的GSH-Px 活力，并且其活力随补硒剂量的增加而增加，表现出明显的浓度和时间效应，即随着日粮中硒浓度的增加及添加时间的延长，GSH-Px 的活力相应增加，但硒剂量进一步升高并不能增加GSH-Px 活性。不同水平的硒产生的功效不同，在试验前期高水平硒比低水平硒更有效。试验结果显示在波尔山羊公羔体内，补适量的硒能够调节体内含硒酶的活性。含硒酶的活力随着日粮中硒剂量的增加而相应提高，但相同浓度的蛋氨酸硒和纳米硒组之间差异不显著。

本试验结果表明不同水平的蛋氨酸硒和纳米硒均能显著提高机体抗氧化能力，在试验前期蛋氨酸硒优于同水平的纳米硒。其原因可能是波尔山羊公羔在缺硒的状态下，机体可以很快利用蛋氨酸硒合成谷胱甘肽过氧化物酶，当机体的缺硒状况得到缓解时，蛋氨酸硒合成谷胱甘肽过氧化物酶的速度变慢，而纳米硒则表现出稳定的增长效应。在第16 周时，相同浓度的纳米硒表现出较蛋氨酸硒稍高的抗氧化能力。

3.2 不同水平的蛋氨酸硒和纳米硒对波尔山羊公羔血清SOD 活性的影响

超氧化物歧化酶对机体的氧化和抗氧化平衡起着重要的作用，该酶能清除超氧阴离子自由基，保护细胞膜免受损伤，SOD 的含量测定结果表明：日粮中添加适量的蛋氨酸硒和纳米硒可显著升高公羔血清SOD 的活性，相同浓度的蛋氨酸硒组和纳米硒组差异不显著。纳米硒组公羔血清中SOD 的活性稍高于蛋氨酸硒组。SOD 作为体内重要的清除活性氧的金属酶，其活性的相对稳定对维持机体的正常生理功能极为重要。赵先英等[5]用vtiC 阻断法测定SOD 活性研究发现硒浓度由0.09mg/kg 增加到0.4mg/kg 时，SOD 活性显著升高，说明硒具有抗氧化作用，与本试验结果一致。

3.3 不同水平的蛋氨酸硒和纳米硒对波尔山羊公羔血清MDA 含量的影响

机体的组织细胞在代谢过程中会产生自由基，而细胞膜含有大量的不饱和脂肪酸，自由基与不饱和脂肪酸发生作用生成MDA 等代谢产物。MDA 的量可以反应出机体内脂质过氧化的程度，间接的反应细胞的损伤程度，MDA 含量测定结果表明：不同水平的蛋氨酸硒和纳米硒可显著降低公羔血清MDA 含量，纳米硒组公羔血清中MDA 含量稍低于蛋氨酸硒组。说明蛋氨酸硒可能产失了更持久的氧化应激。

纳米硒和蛋氨酸硒相比，在生物利用度，如提高GSH-Px 的活力上具有相同的功效，与本试验结果一致。此外，有试验表明纳米硒和蛋氨酸硒相比，具有较低的短期毒性和亚慢毒性[3]。纳米硒在纯粹化学体系的试验中，在氧化还原能力、清除自由基能力上都表现出尺寸效应，即尺寸越小，效率越高[6]。

4 结论

日粮中添加0.1～0.3mg/kg 的蛋氨酸硒和纳米硒均能显著提高波尔山羊肝脏、血液及睾丸中GSH-Px，提高血清SOD 的活性，降低血清中MDA 的含量，提高了机体的抗氧化能力，减轻了机体代谢过程中自由基所致的脂质过氧化损伤。