环状RNA CCDC66A 在肝细胞癌组织中的表达及临床意义

解维敏 闫 奇

肝细胞癌（HCC）通常起源于干细胞的恶性转化，是原发性肝癌的主要类型，也是全球第2 大恶性肿瘤相关死亡原因，其主要的特征是高复发率和异质性[1]。近年来，HCC 的发病率和病死率呈逐年升高趋势，目前其治疗手段存在局限性。HCC患者经手术治疗、放射治疗和化学治疗后易复发，且预后较差[2]。HBV 感染是HCC 发生的主要驱动因素，因此筛选HBV 相关HCC 的治疗靶点和潜在生物标志物至关重要。

环状RNA（circRNA）是一类单链共价闭合RNA，由前体mRNA 剪接产生，前体mRNA 下游5'端与上游3'端相连，构成了circRNA[3]。circRNA 保守性较高，具有组织依赖性，在机体的不同发育阶段呈特异性表达。Wang 等[4]将高通量RNA 测序技术与生物信息学工具相结合，筛选出了HBV 相关肿瘤组织和癌旁组织中circRNA 差异表达谱，研究表明circRNA_10156 在HCC 中发挥着重要调控作用，并提示circRNA 可能是HCC 治疗的生物标志物和干预靶点。卷曲螺旋结构域（CCDC）家族蛋白参与细胞间跨膜信号转导，促进细胞增殖和凋亡，调控肿瘤进展[5]。CCDC 来源的circRNA 同样在肿瘤进展中发挥着重要作用，其中CCDC65 是一种肿瘤相关卷曲螺旋蛋白，与肝癌患者的生存期密切相关[6]。另有研究表明，HCC 组织中CCDC178蛋白表达水平升高，其过表达与疾病病理分期有关[7]。此外，已有研究证实CCDC66 在结直肠癌、胃癌等恶性肿瘤中表达水平显著升高，在肿瘤进展中发挥着促癌作用[8-9]。目前有关CCDC66 在HCC 进展中作用的相关研究报道较少。本文通过检测CCDC66 在HCC 组织中的表达水平，探究其对HCC 预后预测的价值。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

选择2016 年1 月至2017 年6 月在西北大学附属神木市医院行手术切除治疗的106 例HCC 患者作为研究对象，其中男59 例，女47 例，年龄43～79 岁，平均年龄为（59.27±12.20）岁，平均BMI 为（24.63±2.62）kg/m2，患者TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期54 例，Ⅲ～Ⅳ期52 例。收集手术切除的HCC 组织和癌旁组织标本，置于－80 ℃冰箱中保存、待用。纳入标准：（1）穿刺活体组织病理检查结果符合HCC 诊断标准；（2）未进行放射治疗、化学治疗等辅助治疗；（3）入组患者及家属均了解研究内容，并签署知情同意书。排除标准：（1）合并其他脏器恶性肿瘤者；（2）合并自身免疫病者；（3）合并心、肾、肺等脏器功能障碍者；（4）与患者及家属沟通不畅。本研究内容经医院医学伦理委员会批准，且符合赫尔辛基宣言。

1.2 临床资料收集

利用本院的电子病历系统，收集入组患者的年龄、性别、BMI 和乙型肝炎病史等临床资料，术后记录TNM 分期、淋巴结转移情况和肿瘤直径等。

1.3 CCDC66 的表达水平检测

采用实时定量PCR 法检测CCDC66 的表达水平。用TRIzol 试剂盒（购自美国Invitrogen公司）收集HCC 组织及癌旁组织中的总RNA，将总RNA（10 μg）与40 U RNase R（购自美国Epicenter Technologies 公司）在37 ℃下孵育1 h，使用PrimerScript RT 试剂盒（购自日本TaKaRa公司）将RNA 反转录为cDNA，扩增后在PCR仪上检测CCDC66 的表达水平。PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min；之后95 ℃变性15 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共计40 个循环。以U6 作为内参，采用2-ΔΔCt法计算CCDC66 的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 随访

采用电话和门诊的方式对入组患者进行为期5年的随访，随访起始时间为患者术后，每3 个月随访1 次，随访截至2022 年6 月或患者死亡。本研究无失访患者。

1.5 统计学分析

应用SPSS 20.0 软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用非参数t检验。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验。采用Kaplan-Meier 法分析CCDC66的表达水平与HCC 患者术后生存期的关系。采用Cox 比例风险回归模型分析影响HCC 患者预后的危险因素。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 组织和癌旁组织中CCDC66 的表达水平比较

结果表明，HCC 组织中CCDC66 的相对表达量为2.93±0.17，显著高于癌旁组织（1.02±0.26），差异有统计学意义（t＝4.038，P＜0.05）。

2.2 CCDC66 的表达水平与HCC 患者临床病理特征的关系

以CCDC66 相对表达量的中位数（1.89）为临界值，将HCC 患者分为CCDC66 高表达（≥1.89）组和CCDC66 低表达（＜1.89） 组， 结果显示与CCDC66 低表达组相比，CCDC66 高表达组中TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期者、有乙型肝炎病史者、有淋巴结转移者的占比较高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。2 组的年龄、性别、BMI 及肿瘤直径差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表2。

表2 CCDC66 的表达水平与HCC 患者临床病理特征的关系/例（%）

2.3 CCDC66 的表达水平与HCC 患者术后生存期的关系

随访结果显示，CCDC66 高表达组术后5 年存活25 例，生存率为39.68%；CCDC66 低表达组术后5 年存活22 例，生存率为51.16%。CCDC66 高表达组的5 年生存率显著低于CCDC66 低表达组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 CCDC66 的表达水平与HCC 患者生存情况的关系

2.4 CCDC66 的表达水平预测HCC 患者预后的价值

将预后情况作为因变量，将TNM 分期、乙型肝炎病史、淋巴结转移和CCDC66 作为自变量（赋值情况见表3），纳入Cox 单因素回归分析，结果显示TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期、有乙型肝炎病史、有淋巴结转移和CCDC66 高表达均与HCC 患者的预后有关（见表4）。以单因素分析结果中差异具有统计学意义（P＜0.05）的项目作为自变量，纳入多因素Cox 比例风险回归模型分析，结果显示TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移和CCDC66高表达均是HCC 患者预后的独立危险因素（见表5）。

表3 Cox 比例风险回归模型变量赋值表

表4 影响HCC 预后的单因素Cox 比例风险回归模型分析

表5 影响HCC 预后的多因素Cox 比例风险回归模型分析

3 讨论

HCC 是一种常见的消化系统恶性肿瘤，75%以上的HCC 患者在确诊时疾病已进展至晚期，导致患者的病死率较高[10]。目前HCC 患者的5 年生存率可达50%，但70%以上的患者会出现复发和转移，严重影响患者的生活质量[11]。因此，寻找特异性较高且应用价值较高的生物标志物对于改善HCC 的预后具有重要的临床意义。

随着高通量测序技术和生物信息学的发展，研究发现真核细胞中存在大量circRNA[12]。circRNA 是稳定的RNA 分子，具有共价闭环结构，在机体全血、血浆中的表达水平高于线性RNA。circRNA 比线性RNA 的半衰期更长，且稳定性更高[13]。因此，circRNA 可能可以作为多种疾病的生物标志物，在疾病的诊疗及预后预测方面发挥重要作用。circRNA 参与多种生物学过程，其主要通过调控miRNA，参与调节蛋白质表达[14]。CCDC66在多种肿瘤组织中异常表达，已被确定为肿瘤的潜在治疗靶点。研究表明，敲除CCDC66 基因可显著抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力[15]。此外，致癌基因CCDC66 与结直肠癌细胞对奥沙利铂的耐药有关，下调CCDC66 表达可改善结直肠癌细胞对奥沙利铂的耐药[16]。本研究结果表明，与CCDC66 低表达组相比，CCDC66 高表达组中TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期者、有乙型肝炎病史者、有淋巴结转移者的占比较高，且CCDC66 高表达组的5 年生存率较低。多因素Cox 比例风险回归模型分析结果显示，TNM 分期为Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移和CCDC66 高表达均为HCC 患者预后的独立危险因素。

综上所述，HCC 患者肿瘤组织中CCDC66 表达上调，CCDC66 可作为预测患者预后的生物标志物。本研究存在一定的不足之处。首先，本研究的样本量较小，今后应扩大样本量以进一步验证本文结论；其次，本研究未阐明CCDC66 影响HCC进展的具体分子调控信号通路，后续研究可采用流式细胞术、蛋白质印迹法等方法，探究CCDC66对HCC 细胞增殖和调亡的影响。