产广谱细菌素乳酸菌的筛选及体外益生特性的研究

满丽莉,向殿军

(1.内蒙古民族大学 生命科学与食品学院,内蒙古 通辽 028042;2.内蒙古民族大学 农学院,内蒙古 通辽 028042)

我国乳酸菌资源十分丰富,尤其是内蒙古、西藏地区,从传统乳制品中筛选出优良的乳酸菌菌株(活力高、抑菌活性强、抗逆能力强)能为工业化应用提供优良菌种[1]。乳酸菌及所产细菌素在调味品(酸奶味香精基料、发酵香菇调味制品)、食品(乳制品、肉制品、蛋制品、水产品)、医药和饲料等诸多领域应用广泛,且安全性高,乳酸菌细菌素可抑制易引起食品腐败变质和食物中毒的G+和G-菌的生长和活力,可有效地提高食品的质量和安全[2—6]。植物乳杆菌是发酵食品(酸乳、泡菜、发酵香肠)中常见的乳酸菌菌株,具备平衡肠道菌群、增强免疫力、降胆固醇等生理功能,且是人类肠道中的“原住民”之一,定植能力优于罗伊氏乳杆菌、干酪乳杆菌、唾液乳杆菌等,是潜力巨大的益生菌[7—11]。

益生菌可作为抗生素的潜在替代品,具备无抗药性、安全性高、无污染等优势[12-13]。益生菌最好来自健康人或动物寄主肠道的自然菌群、无致病性和毒素产生、耐受消化道环境、具备黏附性和定植能力、产生抗菌物质、不携带可转移耐药性因子等,筛选活力和逆境胁迫能力强的益生菌已成为食品工业和国内外研究的热点问题[14—16]。益生菌的体内活性研究费时且成本高,大多数研究者采用体外益生特性评价,且益生菌株间的评价结果差异也较大,所以每个菌株都必须进行益生特性的体外评价[17]。本研究从不同来源乳制品中分离鉴定产广谱细菌素的乳酸菌,评估了该菌株的抑菌特性和耐受性,为益生菌制剂的筛选及工业应用提供了理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料

供试样品来源于内蒙古地区的奶豆腐、焦克、酸马奶、酸牛奶、奶皮子;指示菌菌株为实验室保存菌株。

1.2 试剂、培养基

培养基、Caco-2细胞、过氧化氢酶、胎牛血清:北京绿源伯德生物科技有限公司;抗菌药物纸片:杭州天和微生物试剂有限公司;其他药品均为国产分析纯或化学纯。

1.3 主要仪器与设备

HVE-50型高压灭菌锅 上海天呈科技有限公司;Harrier 18/80R型高速冷冻离心机 北京迪索仪器有限公司;SDZ5-0-300型数显电子游标卡尺 北京海富达科技有限公司;SPX型生化培养箱 上海丙林电子科技有限公司;MIR-254-PC型恒温培养箱 济南金茂科创科技有限公司;JK236型PCR仪 北京仪诚科技公司;JY04S-3D型凝胶成像系统 成都一科仪器设备有限公司;WIX-midiDNA型电泳仪和电泳槽 广州飞迪生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌株的培养方法

乳酸菌的培养方法:将乳酸菌接种于MRS液体培养基中,37 ℃培养到菌体浓度约为109CFU/mL。

指示菌的培养方法:将菌株分别接种于相应培养基(生孢梭菌和产气荚膜梭菌用RCM培养基;肠炎沙门氏菌和铜绿假单胞菌用LB培养基;单核细胞增生李斯特氏菌用TSA-YE培养基;其余用NB培养基)中,37 ℃培养到菌体浓度约为107CFU/mL。

1.4.2 产广谱细菌素乳酸菌的分离及鉴定

1.4.2.1 菌种的分离及筛选

将100 μL经梯度稀释的供试样品涂布于MRS和M17固体平板上,37 ℃培养3 d,将革兰氏染色(+)、触酶试验(-)的菌株确定为乳酸菌,纯化后备用。将乳酸菌菌液按1%接种于MRS培养基中,30 ℃发酵1 d,发酵上清液制备和抑菌活性检测(双层平板打孔法)按照Man等[18]的方法操作,筛选出具有广谱抑菌活性,且抑菌直径最大的菌株用于后续试验。

1.4.2.2 产广谱细菌素乳酸菌菌株的鉴定

根据《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》、《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版),通过表型特征、生理生化特征和分子生物学方法完成菌株的鉴定。通过扫描电镜和MRS固体平板观察菌株NMD-17的表型特征,运用生理生化管鉴定菌株的生理生化特征。以菌株NMD-17的DNA为模板,应用引物NMD-17-F(5′-GACGAACGCTGSCGGCGTG-CCTAAT-3′)和NMD-17-R(5′-GGTGATCCAACC-GCAGGTTCTCCTA-3′)PCR扩增16S rDNA基因序列。应用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物并测序,同源性比对应用NCBI中的Blast。

1.4.3 菌株NMD-17的抑菌特性研究

1.4.3.1 菌株NMD-17的抑菌谱确定

将按1.4.1培养的菌株NMD-17菌液按1%接种于MRS液体培养基中,30 ℃发酵1 d,应用双层平板打孔法[18]检测菌株NMD-17所产细菌素对27株指示菌的抑菌活性。

1.4.3.2 菌株NMD-17所产细菌素的传代稳定性测定

菌株NMD-17在MRS固体培养基斜面上连续进行30次传代。各代次菌株按照1.4.1的方法培养,菌液按1%接种于MRS液体培养基中,30 ℃发酵1 d,指示菌为鼠伤寒沙门氏杆菌ATCC14028,比较不同代次菌种的抑菌活性,分析植物乳杆菌NMD-17的传代稳定性。

1.4.3.3 菌株NMD-17所产细菌素的发酵动力学曲线测定

将1.4.1培养的菌株NMD-17菌液按1%接种于MRS液体培养基中,30 ℃发酵30 h,每隔3 h取样测定活菌数和抑菌活性。

1.4.4 菌株NMD-17的耐受性研究

1.4.4.1 菌体细胞的制备

菌株NMD-17按1%接种于MRS液体培养基中,37 ℃培养至菌体浓度约为109CFU/mL,8 000 r/min离心10 min(4 ℃),洗涤3次(PBS缓冲液),备用。

1.4.4.2 酸耐受性研究

将菌体细胞重悬于pH值为1.0,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0的MRS培养基中,37 ℃处理4 h,运用平板菌落计数法分别检测0 h和4 h的活菌数,存活率(%)=(处理4 h后的活菌数/处理0 h的活菌数)×100%。

1.4.4.3 热耐受性研究

将菌体细胞重悬于MRS培养基中,在40,50,60,70,80 ℃水浴30 min,运用平板菌落计数法分别检测0 min和30 min的活菌数,存活率(%)=(处理30 min后的活菌数/处理0 min的活菌数)×100%。

1.4.4.4 胆盐耐受性研究

将菌体细胞重悬于胆盐终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的MRS培养基中,37 ℃处理4 h,运用平板菌落计数法分别检测0,1,2,3,4 h的活菌数,存活率(%)=(处理后的活菌数/处理前的活菌数)×100%。

1.4.4.5 渗透压耐受性研究

将菌体细胞重悬于NaCl终浓度为1%、2%、3%、4%、5%的MRS培养基中,37 ℃处理4 h,运用平板菌落计数法分别检测0,1,2,3,4 h的活菌数,存活率(%)=(处理后的活菌数/处理前的活菌数)×100%。

1.4.4.6 氧化耐受性研究

将菌体细胞重悬于过氧化氢终浓度为1,2,3,4,5 mmol/L的MRS培养基中,37 ℃处理4 h,运用平板菌落计数法分别检测0,1,2,3,4 h的活菌数,存活率(%)=(处理后的活菌数/处理前的活菌数)×100%。

1.4.5 菌株NMD-17对Caco-2细胞的黏附性试验

具体参见周晏阳等[19]的方法,黏附率(%)=(黏附Caco-2细胞并洗脱后细胞悬液的相对荧光强度/黏附Caco-2细胞前的相对荧光强度)×100%。

1.4.6 抗菌药物的敏感性试验

应用滤纸片法分析菌株NMD-17的药物敏感性,具体按1.4.1的方法培养菌株NMD-17,将菌液均匀涂布于MRS固体平板后晾干,将42种抗菌药物纸片贴于其表面,37 ℃培养1 d,用数显电子游标卡尺测定抑菌圈直径。

1.4.7 数据分析

试验数据均需重复3次,运用SPSS 19.0软件的ANOVA计算数据的标准差。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选与鉴定

2.1.1 菌株的分离及筛选

从内蒙古地区的奶豆腐、焦克、酸马奶、酸牛奶、奶皮子中共分离出300余株乳酸菌菌株,对鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028具有抑菌活性的菌株有32株,其中菌株NMD-17的抑菌圈直径最大,为(17.48±0.11) mm,将菌株NMD-17用于后续试验。

2.1.2 表型特征及生理生化鉴定

G+短杆菌,无芽孢,两端钝圆,菌落为不透明的规则圆形,乳白色,中间突起,表面光滑湿润,见图1。

图1 菌株NMD-17的菌体形态和菌落形态Fig.1 Cell morphology and colony morphology of strain NMD-17

菌株NMD-17的生理生化鉴定结果见表1,参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)及《常见细菌系统鉴定手册》初步确定菌株NMD-17为植物乳杆菌。

表1 菌株NMD-17的生理生化鉴定Table 1 Physiological and biochemical identification of strain NMD-17

2.1.3 菌株NMD-17的分子生物学鉴定

以菌株NMD-17的总基因组DNA为模板,引物NMD-17-F和NMD-17-R被用于扩增菌株NMD-17的16S rDNA基因,获得一条1 534 bp的特异性片段(见图2),其序列与GenBank中已发布的植物乳杆菌16S rDNA基因序列同源性大于99%,菌株NMD-17为植物乳杆菌。

图3 植物乳杆菌NMD-17所产细菌素对枯草芽孢杆菌ATCC6633(a)、金黄色葡萄球菌ATCC25923(b)和鼠伤寒沙门氏杆菌ATCC14028(c)的抑菌圈Fig.3 Inhibition zones of bacteriocins produced by L. plantarum NMD-17 against Bacillus subtilis ATCC6633 (a), Staphylococcus aureus ATCC25923 (b) and S. typhimurium ATCC14028 (c)

2.2 菌株NMD-17的抑菌特性

2.2.1 菌株NMD-17的抑菌谱

目前商品化的乳酸菌细菌素对G-菌的抑制效果较差,产广谱细菌素的乳酸菌筛选已成为研究热点。与植物乳杆菌LD4、MXG-68、KLDS 1.0391和KL-1所产细菌素相同[18,20—22],植物乳杆菌NMD-17所产的细菌素plantaricin MX对易引起食品腐败变质和食物中毒的G+和G-菌均具有抑制作用,属于广谱细菌素,见表2。

2.2.2 菌株NMD-17所产细菌素的生产稳定性

30代菌株所产细菌素对鼠伤寒沙门氏杆菌ATCC14028的抑菌活性差异均不显著(P>0.05),菌株NMD-17所产细菌素传代稳定性良好,其细菌素的生产性能稳定(见图4),说明植物乳杆菌NMD-17具备较好的生产性能。

图4 植物乳杆菌NMD-17所产细菌素的生产稳定性Fig.4 Production stability of bacteriocins produced by L. plantarum NMD-17

2.2.3 植物乳杆菌NMD-17所产细菌素的发酵动力学曲线

由图5可知,植物乳杆菌NMD-17的生长曲线为S型,延滞期为0～3 h,对数生长期为3～15 h,15 h到达稳定期,24 h出现最大生长量,菌体的延滞期较短,活力强,菌体的最大生长量显著高于植物乳杆菌L3。细菌素的合成量与菌体的生长呈现正相关性,细菌素的合成量在3～24 h呈现上升趋势,24 h(稳定期)时达到最大合成量,达到最大细菌素合成量所需时间显著短于植物乳杆菌A8和植物乳杆菌P158[23],利于实现快速高效发酵。

图5 植物乳杆菌NMD-17的生长曲线及细菌素发酵曲线Fig.5 Growth curve and bacteriocin fermentation curve of L. plantarum NMD-17

2.3 菌株NMD-17的耐受性研究

2.3.1 酸碱耐受性研究

益生菌为发挥维持肠道菌群平衡的作用必须耐受正常人体胃液(pH 1.5～4.5)和肠液(pH约7.6)的pH值,食物在胃和小肠中停留时间一般为1.5 h和1～4 h[24],所以要测定菌株的抗酸碱能力,试验选择的pH为1～10,37 ℃处理4 h。

由图6可知,当pH值为1～6范围内,随着pH值的增加,植物乳杆菌NMD-17的存活率呈现上升趋势,pH值为6时存活率最高(141%),当pH值为6～10时,随着pH值的增加,植物乳杆菌NMD-17的存活率呈现下降趋势。所有处理组中植物乳杆菌NMD-17的存活率均达到69%以上,其酸碱耐受性良好,酸耐受性优于植物乳杆菌R1、植物乳杆菌SWUN5815和植物乳杆菌DJ-04[25-26]。

图6 不同pH值对植物乳杆菌NMD-17存活率的影响Fig.6 Effect of different pH values on survival rates of L. plantarum NMD-17

2.3.2 热耐受性研究

由图7可知,不同温度的热处理对植物乳杆菌NMD-17的生长产生了不同程度的影响,40,50,60 ℃处理30 min后,植物乳杆菌NMD-17的存活率分别达到104%、86%、80%,说明菌株对40～60 ℃的耐受性较好。而经70,80 ℃处理30 min后,植物乳杆菌NMD-17的存活率仅为12%、3%,表明菌株对70 ℃和80 ℃敏感,经30 min加热,菌体绝大部分死亡,与植物乳杆菌R1的热耐受性相似[25]。因此,植物乳杆菌NMD-17在加工、运输和销售过程中应避免60 ℃以上的温度。

图7 不同温度对植物乳杆菌NMD-17存活率的影响Fig.7 Effect of different temperatures on survival ratesof L. plantarum NMD-17

2.3.3 胆盐耐受性研究

抗胆盐能力是乳酸菌具备益生菌特性的关键指标,胆盐在人体小肠中含量为0.03%～0.3%,食物在小肠中停留时间通常为1～4 h,试验选择的胆盐浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%,37 ℃处理4 h[27]。

由图8可知,在同一处理时间下,随着胆盐浓度的增加,植物乳杆菌NMD-17的存活率下降。同一胆盐浓度下,植物乳杆菌NMD-17的存活率随着处理时间的增加而下降。植物乳杆菌NMD-17在0.5%的胆盐、处理4 h条件下仍能保持60%的存活率,该菌株的胆盐耐受性良好,胆盐的耐受能力优于植物乳杆菌R1、植物乳杆菌SWUN5815、植物乳杆菌DJ-04及植物乳杆菌AR326[19,25-26]。

图8 不同胆盐浓度对植物乳杆菌NMD-17存活率的影响Fig.8 Effect of different bile salt concentrations on survival rates of L. plantarum NMD-17

2.3.4 渗透压耐受性研究

人体胃肠道中NaCl的质量浓度范围在1～6 g/dL,且食盐是制作酸菜、泡菜和发酵肉制品等的基本成分,用量一般不超过5%,所以乳酸菌需具备一定的渗透压耐受性才能在肠道和发酵食品中保持活性并发挥益生特性,所以抗渗透压能力是评估菌株体外益生特性的重要指标之一。本试验选择的NaCl浓度为2%、4%、6%、8%、10%,37 ℃处理2 h。

由图9可知,在同一处理时间下,植物乳杆菌NMD-17的存活率随着NaCl浓度的增加而下降。同一NaCl浓度下,植物乳杆菌NMD-17的存活率随着处理时间的增加而下降。植物乳杆菌NMD-17在10%的NaCl、处理4 h条件下仍能保持47%的存活率,说明菌株的渗透压耐受性较强。乳酸菌对低浓度NaCl的良好抵抗力是由于乳酸菌的自身调控能力的启动,但调控能力有限,超过其可耐受的NaCl阈值时,会出现生长限制或死亡现象[28]。

图9 不同渗透压对植物乳杆菌NMD-17存活率的影响Fig.9 Effect of different osmotic pressures on survival rates of L. plantarum NMD-17

2.3.5 氧化耐受性研究

过氧化氢具有强氧化性,易于造成微生物细胞质膜的损害和DNA结构的破坏。过氧化氢适用于环境消毒、食品包装材料等的消毒,菌种在应用过程中难以避免氧化环境。益生菌耐氧性强有利于在加工和保藏过程中保持较高的数量和活力,保证益生菌制品的质量。

由图10可知,在同一处理时间下,随着过氧化氢浓度的增加,植物乳杆菌NMD-17的存活率呈现下降趋势。同一过氧化氢浓度下,随着处理时间的增加,植物乳杆菌NMD-17的存活率亦呈现下降趋势。植物乳杆菌NMD-17在5 mmol/L的过氧化氢、处理4 h条件下仍能保持45%的存活率,说明菌株的氧化耐受性较强。

2.4 植物乳杆菌NMD-17的黏附特性

乳酸菌的黏附性对于调节机体免疫、愈合损伤黏膜、排除病原菌、防止易位和增加定植抗力具有重要作用。作为益生菌需具备黏附肠道上皮组织的能力,同时Caco-2细胞与正常肠道细胞具有相近的形态学和生理学特征,是分析黏附特性及机理的有效模型[29]。植物乳杆菌NMD-17对Caco-2细胞的黏附率为68%,其黏附率高于植物乳杆菌B14(31%)、植物乳杆菌SWUN5815(42%)和植物乳杆菌MXG-68(64%)[30—32],不同益生菌的黏附能力可能与菌株和宿主的特异性有关。

2.5 植物乳杆菌NMD-17的耐药性

耐药性是益生菌筛选的重要指标之一,治疗时应尽量杀灭致病菌而不抑制乳酸菌[33]。植物乳杆菌NMD-17对42种抗菌药物表现出不同的敏感性,见表3。

表3 植物乳杆菌NMD-17对42种抗菌药物的敏感性Table 3 Sensitivity of L. plantarum NMD-17 to 42 antibacterial drugs

对多黏菌素B、环丙沙星、杆菌肽、诺氟沙星4种抗菌药物表现为低敏,对14种抗菌药物包括头孢哌酮、头孢拉啶、利福平、链霉素、洁霉素、四环素、先锋霉素Ⅵ、乙酰螺旋霉素、青霉素、阿奇霉素、新霉素、替考拉宁、氨苄青霉素、恩诺沙星表现为中敏,其余的24种抗菌药物表现为高敏,与侯颖等[25]、李平兰等[34]和丁诗瑶等[35]的研究结果不尽相同。

3 结论

酸马奶亦称马奶酒,流行于我国的内蒙古、新疆等地区,具有免疫调节、抑菌杀菌及防治心血管疾病、消化道疾病、肺结核、肥胖症等功能,典型的酸马奶微生物菌群主要由乳酸菌和酵母菌组成,是产细菌素乳酸菌筛选的良好来源[36—37]。目前筛选到的大部分乳酸菌细菌素仅对G+菌有抑菌活性,而对G-菌的抑菌活性效果较差,筛选广谱、稳定的乳酸菌细菌素已成为研究和工业应用的热点问题[38—39]。本研究从内蒙古酸马奶中分离、筛选、鉴定到一株产广谱细菌素的植物乳杆菌NMD-17,其所产细菌素对易于引起食品腐败变质和食物中毒的G+和G-菌均具有抑菌活性,且菌体的活力强、传代稳定性良好。

发酵食品、功能性食品和益生菌制剂中的乳酸菌需通过口服到达肠道后才能发挥作用,所以乳酸菌需要顺利通过消化道,在肠道中保持一定的数量和活性,要求乳酸菌对酸、碱、胆盐、渗透压具有耐受性,同时对肠道细胞具有一定的黏附性。植物乳杆菌NMD-17在pH为1～10、0.1%～0.5%的胆盐、2%～10%的NaCl,37 ℃处理4 h,存活率均达到47%以上,说明菌株对胃的酸性环境、小肠的偏碱性环境、胆盐环境和渗透压环境均具有良好的耐受性。该菌株对40～60 ℃、30 min的热胁迫和5 mmol/L过氧化氢的氧化胁迫的耐受性较好,更有利于发酵食品的生产和在氧化环境中保持活性。植物乳杆菌NMD-17对Caco-2细胞的黏附率高达68%,且对42种常用的抗菌药物表现出不同程度的敏感性。已有研究显示植物乳杆菌具有较强的酸耐受性和胆盐耐受性[19,24—25],但同时具有高渗透压耐受性的菌株还尚少。综上所述,植物乳杆菌NMD-17具备成为益生菌的潜在能力,其抑菌活性强、抑菌范围广、稳定性良好和安全性高,在调味品、食品等领域将拥有更加广阔的应用价值和发展前景[40—43]。