响应面法优化超声辅助乙醇提取桑葚花青素工艺及稳定性分析

邱菊,陈昌琳,陈冰艺,何贵萍,张佳琪,吕远平*

(1.四川大学 轻工科学与工程学院,成都 610065;2.四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所,成都 610300)

桑葚(MorusalbaL.)又名桑果、乌葚、桑椹等,为桑科(Moraceae)植物桑树的果穗[1]。基础营养物质包括蛋白质、维生素、氨基酸等,在桑葚中含量较高,日常食用桑葚对人体有祛湿、补血、清热、补肾等好处[2]。花青素作为一种高价值的活性物质,在植物王国中的存在感很强,更被称作“天然色素”,具有赋予植物颜色的功能,桑葚果实中也因含有大量花青素而呈现深紫色[3-4]。其生理活性包括抗氧化活性、清除自由基、抗诱变活性和抑菌活性等[5—6]。

桑葚中富含花青素等活性成分而对健康有益,选择合适的提取方法非常重要,不同的提取方法会直接影响其研究及利用[7]。目前超声波法、微波法、有机溶剂法、酶辅助法等是最常用于花青素提取的方法[8]。使用溶剂法提取需要大量的时间,而得率却不高。使用酶法时,酶和色素经常会难以分离。花青素等热敏性化合物的结构在微波的高温下容易遭到破坏。超声波法借助超声波产生的空化现象增强提取效应,达到提高提取率的目的,此法效率高、时间短、成本低[9]。在本试验中,选择桑葚果干作为试验对象,采用超声波乙醇萃取从桑葚中提取花青素,响应面试验优化提取条件,获得最佳提取工艺,有利于花青素的高效利用和保存,考察花青素在不同光照和温度下的稳定性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑葚果干(品种:黑桑):攀乡食品有限公司。

矢车菊素-3-葡萄糖苷(纯度≥98%):成都麦德生科技有限公司;乙醇:重庆川东化工有限公司;盐酸:四川西陇科学有限公司;所用试剂均为国产分析纯。

UV-6000PC紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司;SMF01磨粉机 苏泊尔有限公司;KQ5200DE数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;H1850高速离心机 湖南湘仪集团;PHS-3C pH计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 桑葚粉末的制备

将桑葚果干粉碎过20目标准筛,于干燥皿中密封避光备用。

1.2.2 桑葚花青素的提取

将1.000 0 g桑葚粉末置于150 mL锥形瓶中,以固定浓度的乙醇作为提取溶剂进行超声提取,离心10 min(6 000 r/min),上清液即为花青素提取液。

1.2.3 桑葚花青素的测定

1.2.3.1 标准曲线的制作

以矢车菊素-3-葡萄糖苷为标准品计算桑葚中花青素的含量,该标准品与桑葚花青素强吸收峰一致[10]。在波长530 nm处,测定用pH值3.00的超纯水稀释的不同浓度标品溶液的吸光度,绘制标准曲线。回归方程:y=0.033x-0.006 9,R2=0.999 6。

1.2.3.2 样品花青素的测定

测定稀释一定倍数的1 mL待测液在波长530 nm处的吸光度[11]。花青素得率见公式(1):

(1)

式中:k为桑葚提取液的稀释倍数;c为桑葚提取液的浓度,μg/mL;m为原料量,g;V为桑葚提取液的体积,mL。

1.2.4 单因素试验

选择乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、75%、80%)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,g/mL)、提取时间(10,15,20,25,30 min)、提取温度(30,40,50,60,70 ℃)、超声功率(120,140,160,180,200 W)、溶剂pH(1.00,1.50,2.00,2.50,3.00,4.00,5.00)6个因素进行试验。

1.2.5 响应面优化试验设计

根据单因素试验结果,选择4个试验因素进行响应面优化,即乙醇浓度、提取时间、超声功率、提取温度,固定料液比为1∶20(g/mL),溶剂pH值为2.00。响应面试验因素和水平见表1。

表1 响应面试验因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.6 花青素提取液的稳定性

1.2.6.1 桑葚花青素提取液热稳定性的影响

将花青素提取液分别置于4,25,40,60,80,100 ℃ 6个不同温度下避光保存,每隔2 h取出提取液进行测定,共测定10 h内花青素含量的变化。花青素降解遵循一级动力学模型[12],按公式(2)、公式(3)计算:

Ct=C0e-kt。

(2)

t1/2=ln(2)/k。

(3)

式中:C0为反应起始的含量,mg/g;Ct为一定温度下处理tmin后的含量,mg/g;k为动力学常量;t1/2为降解反应的半衰期,h。

1.2.6.2 桑葚花青素提取液光稳定性的影响

在室温条件下,分别于避光和室内光照的环境下放置花青素提取液进行保存,每隔1 d取出提取液进行测定,共测定花青素在4 d内含量的动态变化。花青素保留率按公式(4)计算:

(4)

式中:A1为放置后花青素的吸光度;A0为放置前花青素的吸光度。

1.3 数据处理

所有数据均取平行试验3次后的平均值,采用Excel软件处理数据,Design Expert 12软件设计Box-Behnken试验,Origin 2018软件绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对桑葚花青素得率的影响

花青素为带有糖基或羟基的极性化合物,根据相似相溶原理以及考虑到桑葚为食品原料,选择乙醇作为提取溶剂,具有无毒无害、成本较低的优点。由图1可知,提取溶剂中的乙醇浓度从40%逐渐提高到70%时,花青素得率快速提升,浓度为40%时花青素得率为3.81 mg/g,而70%时得率为6.25 mg/g,达到最大值。乙醇能够穿透桑葚内部,断裂其中与花青素相连的氢键,使花青素更好地溶解[13]。当浓度超过70%时得率呈现下降趋势,在80%时花青素得率降至3.65 mg/g。因为乙醇浓度会影响提取溶剂的极性,浓度过大导致极性偏离花青素的极性,并且溶出桑葚果实中的醇溶物质,夺取有助于花青素溶解的乙醇-水分子结构[14]。因此,选择乙醇浓度70%的溶剂为宜。

图1 乙醇浓度对桑葚花青素得率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yeild of anthocyanins from mulberry

2.1.2 料液比对桑葚花青素得率的影响

由图2可知,当料液比从1∶5增加到1∶20时,桑葚花青素得率从2.73 mg/g升高到6.84 mg/g,这是由于低料液比时,桑葚粉末在乙醇溶剂中溶解不完全,因而提取不充分,当料液比增大时,原料和溶剂中浓度差加大,接触面积也增大,使得提取更充分,因而得率和料液比呈正相关[15]。继续提高料液比得率没有明显变化,说明花青素已提取充分,继续增大料液比无法进一步促进花青素溶出,增加成本且为后续试验带来不便。因此,选择料液比1∶20为宜。

图2 料液比对桑葚花青素得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of anthocyanins from mulberry

2.1.3 提取时间对桑葚花青素得率的影响

由图3可知,提取时间为10 min时花青素得率为6.4 mg/g,随着时间的延长,在25 min时有最大得率7.29 mg/g,桑葚的内部结构在超声作用下被破坏,提取的有效位点在时间的作用下增多,所以花青素溶出较快,得率升高[16]。当时间继续增加时,花青素物质本身结构不稳定,因而含量降低[17]。因此,选择提取时间25 min为宜。

图3 提取时间对桑葚花青素得率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the yield of anthocyanins from mulberry

2.1.4 超声功率对桑葚花青素得率的影响

由图4可知,当超声功率为120,140 W时花青素得率分别为6.50,6.80 mg/g,在180 W时得率增加到7.38 mg/g。超声波产生的空化、振动等系列现象增强了提取效应,使得桑葚原料的内部结构被破坏,使花青素易于溶出,达到提高提取率的目的[18]。功率超过180 W时,因功率过高改变了花青素的稳定性,得率降低,200 W时得率降至6.98 mg/g。因此,选择超声功率180 W为宜。

图4 超声功率对桑葚花青素得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of anthocyanins from mulberry

2.1.5 提取温度对桑葚花青素得率的影响

由图5可知,提取温度为30～50 ℃时,花青素得率升高,在温度为30,40 ℃时,花青素得率分别为5.36,5.73 mg/g,当温度为50 ℃时,花青素得率升高至7.25 mg/g。升温加速了花青素分子的热运动,使得溶解速率提升,溶解度也随之增大[19]。后续试验中,温度升高到60,70 ℃时,花青素得率没有明显变化,但因过高的温度会破坏花青素结构的稳定性,导致化合物的降解反应。因此,提取温度选择50 ℃为宜[20]。

图5 提取温度对桑葚花青素得率的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield ofanthocyanins from mulberry

2.1.6 溶剂pH对桑葚花青素得率的影响

由图6可知,花青素在酸性溶剂中得率较高,试验结果主要是花青素结构随pH变化导致的[21]。桑葚果实的颜色呈现主要受花青素的影响,而pH影响花青素的颜色呈现。在酸性介质中花青素主要以红色黄烊盐正离子为主导,该结构稳定性好且易溶于水并呈现鲜艳的红色,pH超过3.00时,以黄烊盐正离子结构为主的花青素,逐渐变成趋向无色的甲醇假碱或查尔酮假碱结构,因而化合物的颜色变浅[22]。溶剂pH为3.00时花青素得率仅为4.05 mg/g,pH降低为2.00时,花青素得率显著升高,为7.35 mg/g,但当酸性过强时花青素中的糖苷键和羟基等会被转化,导致桑葚花青素的天然结构被破坏[23]。因此,溶剂pH选择2.00为宜。

图6 溶剂pH对桑葚花青素得率的影响Fig.6 Effect of solvent pH on the yield ofanthocyanins from mulberry

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验结果及方差分析

桑葚果干花青素提取的响应面试验结果见表2,方差分析结果见表3。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface test

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表2试验数据拟合得到回归方程:Y=-113.100 67-1.571 95A+1.275 83B+0.510 783C+0.270 667D-0.004 25AB+0.000 375AC+0.003AD+0.003 125BC-0.002 85BD-0.000 487CD-0.012 709A2-0.027 337B2-0.001 637C2-0.003 297D2。

由表3可知,回归模型的P值小于0.000 1,失拟项的P值为0.276 6,说明模型拟合与实际情况误差很小。相关系数R2=0.993 5,RAdj2=0.986 9,这两个值比较高且相差小于0.2,说明该次模拟能够代替实际试验,对桑葚果干花青素提取的预测结果可信。试验中,一次项A、B、D的P值均小于0.05,说明在桑葚花青素的提取过程中,改变溶剂的乙醇浓度以及提取过程中的温度和时间,均能显著影响花青素的得率。4个二次项A2、B2、C2、D2和4个交互项AB、AD、BC均为极显著水平,交互项BD为显著水平,简单的线性关系不能直接说明4个因素对花青素提取的影响。方差分析中FA=936.51,FB=25.16,FC=1.02,FD=6.49,由F值可知,4个因素的影响次序为乙醇浓度>提取时间>提取温度>超声功率。回归方程中A的系数为负值,表明溶剂提取时,较低的乙醇浓度能够使桑葚花青素提取率更高,与之相比,B、C、D的系数为正值,说明更高的提取时间、超声功率和提取温度可以提高花青素得率。

2.2.2 响应曲面和等高线图分析

响应曲面图和等高线图见图7～图10。

图7 乙醇浓度和提取时间对桑葚花青素得率的影响Fig.7 Effects of ethanol concentration and extraction time on the yield of anthocyanins from mulberry

图8 乙醇浓度和提取温度对桑葚花青素得率的影响Fig.8 Effects of ethanol concentration and extraction temperature on the yield of anthocyanins from mulberry

图9 提取时间和超声功率对桑葚花青素得率的影响Fig.9 Effects of extraction time and ultrasonic power on the yield of anthocyanins from mulberry

图10 提取时间和提取温度对桑葚花青素得率的影响Fig.10 Effects of extraction time and extraction temperature on the yield of anthocyanins from mulberry

2.2.3 最佳工艺确定及验证试验

由软件分析得出,花青素最佳提取工艺为乙醇浓度65.588%、提取时间26.222 min、超声功率181.730 W、提取温度46.125 ℃,此条件下花青素理论得率为7.824 mg/g。将试验条件定为乙醇浓度65%、提取时间25 min、超声功率180 W、提取温度45 ℃,用于实际验证模型的准确性,得出花青素得率为7.815 mg/g,与模型预测的7.824 mg/g相差无几,说明模型具有真实性。

2.3 桑葚花青素提取物的稳定性

2.3.1 不同光照处理对花青素稳定性的影响

室内光照和避光处理影响花青素的保留率,结果见图11。

图11 桑葚花青素的光稳定性Fig.11 Light stability of anthocyanins from mulberry

由图11可知,两种放置方式处理下,花青素含量均降低,光照条件下降低速度快于避光条件,在室温放置1 d后,花青素在避光条件下的保留率为96%,在室内光照条件下为93%,而在4 d后,保留率分别降至84%和80%。这是由于花青素因光照、放置时间等发生反应,降解生成其他物质[24]。

2.3.2 温度对花青素稳定性的影响

由图12和表4可知,花青素在4 ℃冷藏时t1/2为44.4 d,在室温25 ℃储藏时t1/2为25.1 d,降解速率k分别为0.07×10-2和0.12×10-2,因此在长期储存时为保证花青素的有效保存,建议冷藏。而当储藏温度在60 ℃以上时,t1/2迅速降至2.5 d,降解速率k>1.15×10-2,且花青素颜色逐渐由紫红色变为橙色,表明高温使得花青素加速降解和流失[25]。

3 结论

本试验以桑葚果干作为试验原料,用响应面设计分析超声辅助乙醇提取桑葚中花青素的主要影响因素,提高工艺的花青素得率,以及不同光照和温度条件下桑葚花青素的稳定性研究。结果表明,乙醇浓度、提取时间、提取温度及超声功率4个因素影响显著,次序为乙醇浓度>提取时间>提取温度>超声功率。最佳提取条件为乙醇浓度65%、提取时间25 min、超声功率180 W、提取温度45 ℃,经验证,花青素提取实际值为7.815 mg/g,与预测值基本相符。稳定性试验结果显示,避光条件下花青素拥有更高的稳定性,60 ℃以下的温度有利于花青素的保存,温度升高则花青素降解加速。本研究能为扩大花青素的利用提供参考依据。