Neuritin相关信号通路及功能的研究进展

张 玲,虎义平,王庆文

神经蛋白(Neuritin)是一种神经营养因子,又称为候选可塑性相关基因15(candidate plasticity-related genes 15,CPG15),是一种低分泌蛋白,通过候选可塑性相关基因(candidate plasticity-related genes,CPG)锚定在神经元表面,在发育和成熟的神经元表面表达[1]。Neuritin最初是Nedivi在大鼠齿状回中识别参与活动依赖突触可塑性的基因时发现[2]。1996年,Nedivi在筛选CPG库中可能有助于新皮层可塑性的基因时,发现了6个在成人视觉皮层区域对光的反应中被诱导的基因,将其中一个基因命名为CPG15[3]。1997年,Naeve等[1]对CPG15进行研究,发现其表达产物可调节神经元突起的生长,将其命名为Neuritin。人类Neuritin基因位于染色体6P25.3,全长2 072碱基对,表达产物含有142个氨基酸。N末端的27个氨基酸,作为分泌信号肽发挥作用;C末端的27个氨基酸,作为GPI发挥锚定作用,余氨基酸认为是神经肽的核心[1]。Neuritin表达膜结合性和可溶性两种形式的蛋白,膜结合性Neuritin以GPI锚定在细胞质膜上,显示出非细胞自主功能[4]。Fujino等[5]报道在人和小鼠中均发现了Neuritin 2。Neuritin 2和Neuritin具有相似的基因序列及相似的时空表达模式。由这些基因编码的两种异构体(Neuritin 和Neuritin 2)可形成异源二聚体。Neuritin和Neuritin2存在差异表达,其中Neuritin mRNA在脑和肝脏中含量最多, Neuritin 2 mRNA在眼和脑中含量最多。由于Neuritin 2的发现,一些研究人员将该基因编码的蛋白质称为Neuritin 2。目前,Neuritin 2的功能和调节是否与Neuritin不同,有待进一步研究[5]。Neuritin在神经系统之外的多种组织中表达。相关研究使用克隆技术多组织基因板对16个正常成人组织Neuritin的表达进行了分析,结果显示,Neuritin mRNA在人的大脑组织中高表达,与人大脑组织中高表达的Neuritin mRNA水平相比,人的肝脏、心脏、肺、骨骼肌、胸腺、胰腺、胎盘组织中的Neuritin mRNA表达较高;在小肠、脾脏、睾丸、卵巢组织中的Neuritin mRNA表达较低,而在肾脏、结肠、前列腺及白细胞中未检测到Neuritin mRNA表达[6]。现综述Neuritin相关信号通路及其在神经系统、肿瘤、免疫调节方面的作用。

1 与Neuritin调节相关的信号通路及受体

Neuritin是一种重要的神经营养素,可调节神经发育、突触可塑性和神经元存活。近年来发现其在肿瘤发生和免疫调节等发挥一定作用,阐明其下游分子信号转导对Neuritin在神经、肿瘤、免疫等疾病中的潜在治疗应用具有重要意义。Fujino等[7]研究突触活动导致Neuritin转录激活的途径中发现,Neuritin是一个由多个信号转导途径、启动子元件和转录因子调控的即刻早期基因(immediate-early gene,IEG),与突触可塑性密切相关。脑缺血后星形胶质细胞中神经元特异性蛋白Neuritin的表达显著增加,Neuritin以可溶性形式从受缺血刺激的星形胶质细胞中分泌,可能通过黏附在神经元表面,促进神经元突起生长的保护和恢复。星形胶质细胞中Neuritin表达上调可能通过丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)和上游的酪氨酸激酶(tyrosine kinase,TrkA)信号通路及环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)转录因子的磷酸化激活。星形细胞分泌的Neuritin蛋白可能与神经元中的脑特异性血管生成抑制因子1相关蛋白2(brain-specific angiogenesis inhibitor 1-associated protein 2,BAIAP2)和富含亮氨酸的重复序列和含纤连蛋白Ⅲ型结构域的蛋白2(leucine-rich repeat and fibronectin type Ⅲ domain-containing protein 2,LRFN2)相互作用,介导细胞内信号,调节神经元细胞下游基因如GTP酶激活蛋白20(GTPase-activating proteins 20,GAP20)、GTP酶激活蛋白22(GTPase-activating proteins 22,GAP22)、GTP酶激活蛋白29(GTPase-activating proteins 29,GAP29)和E1A结合蛋白p400(E1A binding protein p400,EP400)表达,从而促进神经元突起生长和抑制神经元损伤[8]。大鼠小脑颗粒神经元暴露于Neuritin后,可诱导蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)磷酸化,促进神经元发育,其机制可能与激活胰岛素受体信号通路有关[9]。

Zhang等[10]研究显示,糖尿病小鼠海马内Neuritin高表达,抑制星形胶质细胞系U-118MG中的Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)/信号转导和转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信号通路,从而抑制星形胶质细胞增生并改善糖尿病认知功能障碍、神经元损伤和突触可塑性。N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)型谷氨酸受体(N-methyl-D-aspartate-type glutamate receptor,NMDAR)激活,参与突触强化和建立新突触所需的多种细胞途径[11-12],最终通过表达α-氨基-3-羟基-5-甲基-4异恶唑丙酸(AMPA)型谷氨酸受体(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid-type glutamate receptor,AMPAR)突触插入实现[13-14]。Cantallops等[15]对非洲爪蟾视顶盖神经元的全细胞记录表明,突触后过表达Neuritin可促进突触前视网膜神经节细胞轴突投射的树状化,通过募集突触功能性AMPA受体促进视网膜顶盖突触成熟,并维持已建立的突触,缺少GPI锚的Neuritin表达未促进轴突乔木的生长。表明Neuritin通过NMDA型谷氨酸受体、AMPA型谷氨酸受体促进突触成熟。相关研究显示,Neuritin对突触后密度蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD95)的招募是通过与AMPA受体的相互作用实现的,Neuritin通过AMPA受体募集PSD95促进兴奋性突触的稳定和成熟,PSD95的招募反之又促进AMPA受体的进一步插入,产生结构稳定且功能成熟的突触。与其他分泌的细胞外突触介质分子不同,Neuritin以膜结合形式发挥作用,GPI膜锚定使其能与AMPA受体相互作用[16]。

Neuritin除了在神经系统、肿瘤中发挥作用外,也参与了血管生成。有研究表明,随着Neuritin表达量增加,星形细胞瘤微血管密度增加[17]。有研究显示,缺氧情况下,Neuritin蛋白在上皮细胞中过表达[18]。Notch信号通路在血管形成的调节中发挥重要作用,参与血管形成的多个步骤[19]。小鼠基因靶向研究表明,Notch1是发育性血管生成过程中发挥主要功能的Notch受体[20]。δ样4(delta-like 4,DLL4)是第一个在小鼠发育过程中被表达的Notch配体[21]。Zhang等[22]研究显示,Neuritin与Notch1信号通路密切相关,且为负调控因子,Neuritin可与Notch1信号配体的正调控因子神经元化E3泛素蛋白连接酶1(neuralized E3 ubiquitin protein ligase 1,NEURL1)相互作用。Neuritin通过抑制NEURL1抑制Notch1信号通路,是Notch1信号通路的上游负调控因子。进一步研究表明,Neuritin可能通过调控DLL4/Notch通路表达促进血管生成[23],具体机制尚未明确。有研究使用酵母双杂交筛选发现NEURL1通过促进Notch配体的内吞激活Notch信号,免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)分析确定了Neuritin和NEURL1存在相互作用,证实了Neuritin和NEURL1共同定位在SH-SY5Y细胞膜上。Neuritin显著抑制NEURL1促进的Notch配体Jagged1(JAG1)内吞,进而抑制Notch受体Notch胞内结构域的激活,降低下游基因hairy和split-1增强子(hairy and enhancer of split-1,HES1)表达;Neuritin抑制Notch信号的作用被NEURL1改善,表明Neuritin是NEURL1的上游和负调节因子,通过与NEURL1的相互作用抑制Notch信号[22]。重组Neuritin恢复了Notch激活引起的神经突起回缩。上述研究证实了Neuritin是NEURL1的上游和负调节因子,抑制Notch信号可促进神经突起生长。这一机制将Neuritin与Notch信号联系起来,为进一步研究Neuritin在神经发育和神经可塑性中的作用提供了有价值的线索。

MicroRNAs(miRNAs)是一种小的非编码RNA,70%的已知miRNAs在哺乳动物大脑中表达,miRNAs参与神经发育及存活的各方面,miRNAs失调导致各种神经系统疾病。相关研究显示,miR-204是Neuritin表达的负调节因子,抑制Neuritin蛋白质表达,miR-204可激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3),增强雪旺细胞对氧化应激的敏感性并诱导其凋亡;因此,miR-204的低表达可减轻对Neuritin转录的抑制,提高雪旺细胞的抗凋亡能力,进而为受损神经的修复创造适合的微环境[24]。有研究显示,在氧化应激下Neuritin表达降低,过表达Neuritin可提高抗氧化超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性,降低环氧合酶2(cyclooxygenase 2,COX2)和氧化产物丙二醛(malonaldehyde,MDA)表达,提示其在缓解神经细胞氧化应激中的作用和潜在机制,结果表明,核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)抗氧化途径参与了Neuritin介导的氧化应激缓解[25]。Neuritin至今发现有二十余年,关于它的功能有大量的研究,但关于作用的信号通路及可能的受体或可能被激活的路径较少,仍需进一步深入研究,了解Neuritin及其在神经退行性疾病和肿瘤等疾病中可能的治疗作用。

2 Neuritin在神经系统中的作用

Neuritin最早在神经系统中发现,大量研究报道其在神经系统方面发挥作用,Neuritin可抑制神经元凋亡、促进突触发育和成熟及神经元迁移等。提示Neuritin可能是神经系统疾病的潜在治疗靶点。

2.1 Neuritin抑制神经元凋亡

Zhang等[26]研究显示,Neuritin主要通过改善脑水肿程度、减轻血脑屏障破坏和降低神经元凋亡,减轻蛛网膜下腔出血病人早期脑损伤,进而在蛛网膜下腔出血中发挥神经保护作用,初步探讨了内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)在神经细胞凋亡通路中的作用。ERS通路是一类凋亡通路,可激活脑缺血损伤的神经元,在神经凋亡中发挥抑制作用。进一步研究显示,Neuritin抑制神经元凋亡可能是通过ERS通路介导的[27],但具体的作用机制需进一步深入研究。有研究表明,Neuritin通过减少脑损伤和水肿、抑制神经元死亡、增加神经元连接,改善脑出血小鼠的神经功能缺损[28]。有研究显示,Neuritin通过抑制特定神经母细胞亚群中的凋亡,在哺乳动物前脑形态发生过程中调节大脑大小和形状[29]。有研究显示,Neuritin通过促进体外自噬流量减轻氧-葡萄糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)诱导的神经元损伤,从而发挥神经保护作用[30]。Neuritin抑制神经元损伤后Caspase-3激活,进而减少神经元细胞凋亡[31]。有研究表明,Neuritin可下调半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(cysteinyl aspartate specific proteinase 8,Caspase-8)表达水平,Caspase-8可能介导ESR反应进而抑制神经元凋亡[32]。

2.2 Neuritin 促进突触发育和成熟

Neuritin通过促进神经突生长和突触成熟,在神经发育和再生中发挥关键作用。Cantallops等[15]通过对非洲爪蟾视顶盖神经元的全细胞记录表明,Neuritin的突触后过表达促进了突触前视网膜神经节细胞轴突投射的树状化,并通过募集突触的功能性AMPA受体促进视网膜顶盖突触成熟,并维持已建立的突触。研究突触活动导致Neuritin转录激活的途径发现,Neuritin是一个由多个信号转导途径、启动子元件和转录因子调控的即刻早期基因(immediate-early gene,IEG),且与突触可塑性密切相关[7]。Fujino等[33]通过Neuritin基因敲除(Neuritin KO)小鼠模型,结果显示,Neuritin KO小鼠模型中兴奋性突触的形成和成熟延迟,提出Neurutin具有稳定树突棘上新生突触的作用。突触后致密区蛋白95(post synaptic density 95,PSD95)是一种在突触部位聚集和稳定谷氨酸受体的支架蛋白[34],PSD95的募集依赖于突触活动[35]。有研究显示,Neuritin对PSD95的招募是通过与AMPA受体的相互作用实现的,Neuritin通过AMPA受体募集PSD95促进兴奋性突触的稳定和成熟,PSD95的招募反之又促进AMPA受体的进一步插入,从而产生结构稳定、功能成熟的突触。与其他分泌的细胞外突触介质分子不同,Neuritin以膜结合形式发挥作用,其GPI膜锚定使其能与AMPA受体相互作用[16]。Klussmann等[36]研究显示,Neuritin通过增加突触上AMPA受体数量,发挥促进视顶盖突触成熟的作用。Neuritin参与脑发育过程中的突触可塑性,这一过程依赖神经元迁移。有研究分析Neuritin表达,结果显示,Neuritin在迁移永生化神经元(GN11细胞)小鼠模型中高表达,在非迁移神经元小鼠模型(GT1-7细胞)中不表达;当Neuritin过表达时,GN11细胞迁移增强,当Neuritin沉默时,GN11细胞迁移减弱,证实了Neuritin可促进神经元细胞迁移,促进突触发育[37]。

2.3 Neuritin在神经系统中的其他作用

糖尿病中枢神经病变是糖尿病的严重并发症,以认知功能障碍、神经化学和结构障碍为主,2型糖尿病病人有较高的认知功能障碍风险,存在短期记忆和执行功能缺陷[38]。JAK2/STAT3信号通路已成为星形胶质细胞反应性的中央调节因子,并在调节突触可塑性、反应性胶质细胞增生和认知功能障碍的动物模型中发挥关键作用[39]。星形胶质细胞可调节神经元兴奋性、突触可塑性和活动,并在学习和记忆等认知功能中发挥关键作用。星形胶质细胞调控认为是信息和记忆形成的细胞基质加工焦点[40]。星形胶质细胞激活诱导的胶质细胞增生引起海马神经元损伤,导致认知功能障碍[41]。有研究表明,Neuritin过表达可抑制2型糖尿病小鼠海马内激活的JAK2/STAT3信号通路,而JAK2/STAT3信号通路抑制U-118MG细胞内脂多糖诱导的胶质细胞增生,显著改善认知功能障碍、海马神经元损伤和突触可塑性退化[10]。在骨髓中Neuritin过表达对2型糖尿病小鼠周围神经病变影响的研究发现,骨髓中Neuritin过表达可改善高血糖,预防糖尿病周围神经病变,保护坐骨神经超微结构和表皮内神经纤维密度,促进坐骨神经施万细胞增殖和髓鞘再生。Neuritin在体外通过基质细胞衍生因子-1α(stromal-derived factor-1 alpha,SDF-1α)/c-x-c趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptor type 4,CXCR4)-PI3K/AKT信号通路改善骨髓间充质干细胞迁移,进而改善骨髓的局部神经病变[42]。Neuritin过表达转基因小鼠表现为海马中DNA修复因子聚[二磷酸腺苷(ADP)-核糖]聚合酶1的降解减少,表明海马细胞凋亡率降低,且在短暂性全脑缺血后第一周期存活的海马神经元数量更多,Neuritin过表达小鼠表现为再生标志物神经丝蛋白(neurofilament protein 200,NF-200)、突触素和生长相关蛋白-43(growth associated protein 43,GAP-43)表达增加,空间学习和记忆恢复改善,结果表明,转基因小鼠脑缺血后神经恢复的时间窗提前,提示Neuritin可作为改善脑缺血损伤预后的新型治疗策略[43]。小鼠中Neuritin的敲除可加速视神经损伤后视网膜神经节细胞丢失和视网膜变性[44]。腺病毒相关介导的Neuritin过表达延迟视神经损伤后视网膜神经节细胞凋亡,损伤轴突再生,维持视网膜神经节细胞功能[45]。玻璃体内注射重组Neuritin作为基因治疗,可减轻视网膜神经节细胞凋亡并促进视神经挤压后视神经轴突再生。有研究采用rAAV2(病毒编号)介导的Neuritin过表达载体(AAV2-Neuritin)通过玻璃体内注射治疗视神经挤压,结果表明,AAV2-Neuritin主要转染到视网膜神经节细胞中,Neuritin过表达显著减少了视网膜神经节细胞凋亡,促进了视神经再生和视觉功能恢复[46]。

3 Neuritin在肿瘤中的作用

Neuritin可在多种组织中表达。有研究通过人类癌症转录组数据库--癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)分析了31种人类癌症中的Neuritin表达水平,结果表明,Neuritin在子宫内膜癌、肺腺癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、结肠腺癌、直肠腺癌、宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌、多形性胶质母细胞瘤、嫌色性肾细胞癌、肾乳头状肾细胞癌、低级胶质瘤、卵巢浆液性囊腺癌中显著上调,在淋巴肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤中下调,对12种人类癌症的生存分析,Neuritin 可能在抑制肿瘤生长或发育中发挥重要作用[6]。提示Neuritin可能作为这些癌症的生物标志物和治疗靶点。相关研究建立病人来源癌症/病人来源癌症异种移植(patient-derived cancer/patient-derived cancer xenograft,PDC/PDCX)模型,表明Neuritin可促进体外和体内肾细胞癌增殖,且Neuritin沉默下调CXCR4,CXCR4是与Neuritin共表达的基因,Neuritin与CXCR4共同在肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)中表现出肿瘤促进作用,确定Neuritin是肾细胞癌的不良预后生物标志物[47]。Yuan等[48]研究显示,胃癌组织中Neuritin表达高于癌旁正常组织。

相关研究显示,涉及细胞周期、DNA损伤修复(DNA damage repair,DDR)、Wnt、转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)途径的基因中存在异常的DNA甲基化[49-50]。DDR途径维持着细胞遗传物质的稳定,DDR途径缺陷时,可增加细胞癌变的风险。多项研究表明,PI3K-AKT-mTOR、NF-κB和Wnt通路参与了DDR[9,51]。相关研究显示,Neuritin参与PI3K-AKT-mTOR通路[52]。有研究显示,Neuritin抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭、集落形成,并诱导食管癌细胞凋亡和G1/S期停滞;Neuritin在人类食管鳞状细胞癌中经常发生DNA甲基化,且Neuritin的表达受启动子区甲基化的调节,进一步研究显示,Neuritin甲基化激活了食管癌细胞中的PI3K-AKT-mTOR信号,Neuritin甲基化是联合PI3K和ATR抑制剂的协同致死治疗的新型预后标志[53]。

4 Neuritin与自身免疫性疾病的关系

以往Neuritin的研究多关于神经系统、肿瘤等,近年来发现其在自身免疫性疾病中也发挥着一定的作用。自身免疫性疾病是以机体自身反应性T、B细胞过度活化,进而产生大量自身抗体,通过自身免疫反应,破坏和损伤自身组织或细胞成分,引起机体多器官、多系统损伤为主要特征的慢性炎症性疾病[54]。调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)在自身免疫性疾病中的作用已成为研究的热点。相关研究认为,当Treg细胞异常时,其不能有效抑制自身反应性效应T细胞,引起效应T细胞与B细胞大量增殖或功能加强,导致自身免疫性相关抗体的分泌增多或针对自身抗原的相关细胞功能增强,最终导致相关器官或组织病理变化[55]。

有研究显示,诱导和天然的Tregs可高表达Neuritin,Neuritin通过稳定叉头框蛋白P3(recombinant forkhead box P3,FOXP3)表达,并促进这些细胞的持久性维持Treg池,敲除Tregs中的Neuritin基因或抗Neuritin抗体治疗可减轻Tregs依赖的结肠炎和实验性自身免疫性脑炎的缓解[56]。有研究显示,生发中心的滤泡调节性T细胞(Tfr)通过分泌Neuritin可抑制B细胞驱动的自身免疫和IgE介导的过敏性反应发展[57]。Neuritin缺乏是先前研究未认识到的过敏性和自身免疫性疾病发展的关键因素。再次证实Neuritin在自身免疫性疾病中的作用。

5 小结与展望

Neuritin是近年来发现的一种神经营养因子,可抑制神经元凋亡、促进突触发育和成熟及神经元迁移等,上述作用提示Neuritin可能是神经系统疾病的潜在治疗靶点。以往对Neuritin的研究主要集中在神经系统,但越来越多的研究表明,Neuritin在神经系统以外的某些组织中也有表达。Neuritin在多种肿瘤组织中高表达,肿瘤细胞的生长依赖新生血管为其提供充分的血供及营养。Neuritin可增加微血管密度,促进体内外血管新生,是一种潜在的促进肿瘤血管生长的因子,提示Neuritin可能作为癌症的生物标志物和治疗靶点。Neuritin可能在自身免疫性疾病中发挥抗炎作用,但具体的作用机制尚未明确。Neuritin的作用机制需进一步多中心、大样本的随机对照试验,探索发现Neuritin更多特性,有助于开发新的临床治疗思路及手段,挖掘其在神经系统、肿瘤、自身免疫性疾病和其他疾病的诊疗中的潜在价值。