紫外和荧光光谱法研究油菜蜂花粉多酚对胰脂肪酶的作用过程

张 楠，胡童霞，朱鑫麗，杨雪梅，王 磊，吴 帆，李红亮,

（1.中国计量大学生命科学学院，浙江杭州 310018；2.浙江分阳检测有限公司，浙江杭州 311519）

蜂花粉是蜜蜂采集显花植物花蕊内的花粉粒后混入自身腺体分泌物及花蜜的不规则扁球形团状物，再由蜜蜂的携粉足带回蜂巢，经脱粉器收集而来[1]。蜂花粉含有多种营养成分以及功能性物质，如蛋白质、多酚、脂肪、多糖及微量元素等[2]。作为传统的天然营养食品和理想的滋补品，蜂花粉具有一定的医疗和保健作用，如增强免疫力、抑制前列腺疾病、防癌作用和降脂减脂等功能[3-4]，其中多酚类化合物是蜂花粉重要的功能活性成分[5]。

多酚化合物是指分子结构中含有若干个酚羟基的植物源化合物，主要包括黄酮类、单宁类、酚酸类和花色苷类。酚类化合具有降血脂、降血糖、清除自由基、抗动脉粥样硬化以及抗炎等功能，因而备受人们关注。杨佳林等[6]通过分离蜂花粉酸解液发现槲皮素和山奈酚为其主要抗氧化活性成分，另外研究表明山茶蜂花粉多酚对氧嗪酸钾诱导的高尿酸血症具有治疗作用[7]。近年来，已有一些与蜂花粉降脂相关的研究，Rzepecka-stojko 等[8]证明了富含多酚的蜂花粉乙醇提取物可以减少动脉粥样硬化小鼠模型C57BL/6 因高脂饮食引起的肝脏脂肪变性和退行性变化的发生，同时在给予蜂花粉多酚能够有效降低引起高脂饮食小鼠动脉粥样硬化有关物质的形成。Li等[9]利用玫瑰蜂花粉多糖对HepG 2 细胞和高脂饮食诱导的肥胖小鼠作用，研究其对胰岛素功能和脂质代谢的影响，结果表明蜂花粉多糖通过AMPK/mTOR 介导的信号通路促进自噬，从而减轻肝脏脂肪变性和胰岛素抵抗，提示其可能是一种新的治疗肥胖和糖尿病药物。

胰脂肪酶是体内参与脂代谢的关键酶[10]，它可以催化酯类生成脂肪酸和甘油，而胰脂肪酶抑制剂则通过抑制胰脂肪酶的活性来阻止脂肪的积累，从而达到减脂的功效[11]。因该类抑制剂具有不进入血液循环、不作用于神经系统、不抑制食欲等特点，备受人们的关注。来源于天然植物的胰脂肪酶抑制剂已经成为减肥保健产品的研究热点[12]，其具有较其它非天然来源（如有机合成和微生物来源）诸多优点如活性稳定、副作用小等[13]，愈来愈受到人们的重视。研究发现菠菜多酚水提取物对胰酶有较明显的抑制作用[14]，任秀娟[15]和田强[16]等研究发现葡萄籽提取物原花青素等多酚类物质对胰脂肪酶有明显的抑制作用，且该抑制作用多为非竞争性抑制。但对于蜂花粉多酚的降脂机制尚未见报道。

由于研究植物多酚类物质与酶、血清白蛋白等蛋白质的相互作用能对于植物多酚物质的利用和人体吸收提供数据参考，因此本研究以油菜蜂花粉多酚为研究对象，首先利用超声波辅助乙醇提取法提取其中的多酚类物质，再分别利用酶动力学和荧光光谱技术探究其对胰脂肪酶的抑制作用过程。本实验结果为蜂花粉的降脂作用及进一步食品功能开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

干燥油菜蜂花粉 杭州天厨蜜源保健品有限公司提供，均于-20 ℃保存；脂肪酶 30000 U/g（来源于猪胰脏），北京百灵威科技有限公司；4-硝基苯基月桂酸酯（p-NPB）上海阿拉丁试剂有限公司；福林酚试剂 生工生物公司（上海）股份有限公司；二甲亚砜、无水乙醇、Tris 缓冲溶液及其他试剂 均为国产分析纯。

RF-5301PC 型荧光分光光度计、UV-1800 型紫外可见分光光度计 日本岛津公司；FlexA-200 型酶标仪 杭州奥盛仪器有限公司；Rotavapor R-210 型旋转蒸发仪 瑞士布奇公司；KQ-250DB 型数控超声提取仪 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 油菜蜂花粉多酚的提取和含量测定 油菜蜂花粉多酚的提取参照张燕新[17]的方法并稍有改进，取100 g 油菜蜂花粉样品，研磨后过60 目筛，按料液比1:10 加入75%乙醇溶液在50 ℃下进行超声（功率200 W）提取1 h，重复提取三次合并滤液。旋转蒸发仪减压浓缩后，稀释至合适浓度再进行乙酸乙酯萃取，利用旋转蒸发仪蒸发至干后冷冻干燥得油菜蜂花粉多酚提取物备用。

总多酚含量测定采用福林酚法[18]并稍作改动，配制质量浓度为0.005、0.010、0.015、0.020、0.025mg/mL 的没食子酸标准品液，加入0.5 mL 福林酚试剂与10%的Na2CO3溶液1.5 mL，避光反应后利用紫外分光光度计测定747 nm 波长处的吸光度。以没食子酸质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，测定三次取平均值进行计算。得到拟合方程为y=66.82x+0.4517，其R2=0.9987，测得没食子酸计的油菜蜂花粉多酚含量为71.2%。

1.2.2 蜂花粉多酚对胰脂肪酶活性的影响 胰脂肪酶活性测定及计算方法参考张静等[19]并稍作改动。将适量胰脂肪酶溶解于0.25 μmol/L 的Tris 缓冲溶液作为储备液，12000 r/min 离心3 min 后取上清液即为5 mg/mL 的胰脂肪酶工作液，用二甲亚砜配制10 mmol/L 的底物p-NPB 溶液和不同质量浓度（0、0.142、0.356、0.570、0.712、1.068、1.424、2.136 mg/mL）的油菜蜂花粉多酚溶液。在酶标板中每孔加入10 μL 的蜂花粉多酚提取物、30 μL 胰脂肪酶溶液、20 μL Tris 缓冲液作为实验组，不加胰脂肪酶和多酚提取物为空白组，不加多酚提取物为实验对照组，不加胰脂肪酶为溶剂对照组。设置酶标仪孵育温度为37 ℃并孵育15 min 后，加入40 μL 的底物溶液，轻轻吹打混匀后继续孵育15 min，并于405 nm处测定吸光度，通过公式（1）得到酶相对活性。以油菜蜂花粉多酚提取物的质量浓度为横坐标，纵坐标为酶相对活性，绘制曲线并进行多元线性拟合，再利用回归方程同时计算蜂花粉多酚的半抑制浓度（IC50），所有组别平行测定三次。

式中，A1为实验组吸光度；A2为空白组吸光度；A3为实验对照组吸光度；A4为溶剂对照组吸光度。

1.2.3 油菜蜂花粉多酚对胰脂肪酶的抑制类型判定 固定底物浓度为10 mmol/L 不变，分别测定不同质量浓度的油菜蜂花粉多酚溶液（0、0.712、1.424 mg/mL）和不添加酶抑制剂时，不同酶浓度下的反应速率。以1.2.2 中实验组体系进行反应，并以不加抑制剂为对照组。反应速率为反应后的体系吸光度与反应时间相除，以胰脂肪酶质量浓度为横坐标，反应速率为纵坐标绘制曲线，基于曲线斜率初步判断抑制类型[20]。

固定胰脂肪酶质量浓度为5 mg/mL 和油菜蜂花粉多酚提取物浓度为IC50，加入不同浓度的底物p-NPB 溶液（0.5、1、2、3、4 mg/mL），以1.2.2 中实验组体系进行反应。以底物浓度的倒数（1/[S]）为横坐标，纵坐标为反应速率的倒数（1/v），绘制Lineweaver-Burk 双倒数曲线[21]。

1.2.4 油菜蜂花粉多酚作用于胰脂肪酶的紫外-可见吸收光谱分析测定 将胰脂肪酶工作液与不同质量浓度的油菜蜂花粉多酚溶液混匀，室温作用5 min 后取适量反应液于石英比色皿，并在250～400 nm 范围内进行紫外-可见吸收光谱扫描。

1.2.5 荧光发射光谱及同步荧光光谱分析测定 将不同浓度的油菜蜂花粉多酚提取物加入胰脂肪酶工作液中，调整油菜蜂花粉多酚提取物与胰脂肪酶的用量比。分别在不同温度（298 和308 K）下振荡混匀并静置5 min，设置仪器的激发波长为280 nm，发射波长扫描范围300～500 nm，狭缝宽为5 nm 进行荧光发射光谱扫描。

改变荧光光谱仪的激发波长和发射波长之间的波长差（Δλ）分别为15 和60 nm，进行同步荧光光谱扫描，其余测量条件和发射光谱实验条件一致[22]。

1.2.6 荧光猝灭机理和结合常数分析 根据荧光光谱峰值，结合式（2）进行荧光猝灭机理和结合常数的分析，以F0/F 为纵坐标，[Q]为横坐标绘制Stern-Volmer 曲线，斜率即为猝灭常数（KSV）[23]，通过计算得到双分子碰撞猝灭常数（Kq）。

式中，F0为不加样品时的荧光强度；F 为加入样品后的荧光强度；τ0为生物分子的荧光寿命（10-8）；[Q]为样品的质量浓度。

1.3 数据处理

使用Microsoft Excel 2016 软件进行数据处理，以及GraphPad Prism 8.0 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 蜂花粉多酚对胰脂肪酶的抑制作用

如图1 所示，随着提取物的浓度增大，胰脂肪酶的活性也随之降低，呈现质量浓度依赖性，蜂花粉多酚引起胰脂肪酶的活性降低50%的质量浓度为1.670±0.045 mg/mL。由此可见，油菜蜂花粉多酚提取物对胰脂肪酶的具有较好的抑制效果。张静等[19]发现黑果枸杞花色苷提取物对胰脂肪酶的半抑制质量浓度为2.84±0.45 mg/mL，与本实验结果类似。

图1 油菜蜂花粉多酚对胰脂肪酶活性的影响Fig.1 Effects of rape bee pollen polyphenols on pancreatic lipase activity

2.2 蜂花粉多酚对胰脂肪酶的抑制类型

底物浓度为10 mmol/L 不变，改变酶浓度，以反应速率对酶的质量浓度进行作图，得到经过原点的直线。由图2A 可知，随着蜂花粉多酚浓度增加，直线斜率逐渐降低，且曲线均经过原点，说明油菜蜂花粉多酚通过降低酶活性使得反应速率减小，而不是通过降低酶量，说明此过程为可逆性抑制过程[24]。固定胰脂肪酶的质量浓度，改变底物的浓度，Lineweaver-Burk 双倒数曲线如图2B，曲线均相交于第二象限，为非竞争性与竞争性混合的抑制类型[25]。黄桂丽等[26]证实枇杷花多酚对胰脂肪酶的抑制类型为可逆混合型抑制，半抑制质量浓度为66.1±6.36 μg/mL，与本研究的结果比较类似，表明植物提取多酚对于胰脂肪酶的抑制类型具有一定相似性。

图2 油菜蜂花粉多酚对胰酶的抑制类型与Lineweaver-Burk 双倒数曲线Fig.2 Inhibitory types and Lineweaver-Burk double reciprocal curve of rape bee pollen polyphenols on pancreatic lipase

混合型抑制是特异性抑制和酶催化作用同时存在的抑制类型，KI表示抑制剂与酶的复合物（EI）的离解常数，而KIS则表示抑制剂与酶-底物的复合物（EIS）分解出抑制剂（I）时的离解常数，KI与KIS的大小均与抑制剂的抑制作用效果呈反比[27]。根据Lineweaver-Burk 双倒数曲线计算在有无油菜蜂花粉多酚存在时斜率的比值（1+[Q]/KI）以及纵轴截距的比值（1+[Q]/KIS）即可求得KI及KIS，计算结果见表1。当油菜蜂花粉多酚质量浓度一定时，1/KI>1/KIS，即多酚与胰脂肪酶的亲和力大于多酚与底物-酶复合物的亲和力[28]，表明油菜蜂花粉多酚对胰脂肪酶的抑制现象是竞争性与非竞争性抑制两种混合的结果。王燕飞等[29]发现米胚芽中的胰脂肪酶抑制剂是通过间接改变底物乳化来阻碍底物与酶的而结合，不直接与酶作用。

表1 Lineweaver-Burk 双倒数曲线参数Table 1 Lineweaver-Burk double reciprocal curve parameters

2.3 油菜蜂花粉多酚作用于胰脂肪酶的紫外-可见吸收光谱分析

胰脂肪酶中含有芳香族氨基酸如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，这也决定了其在260 nm 左右存在最大吸收波长。由图3 可知，胰脂肪酶除了在260 nm处有最大吸收峰外同时随着油菜蜂花粉多酚浓度的增加，250～280 nm 处的吸收峰值增强并出现了红移现象，这也说明了胰脂肪酶结构中的芳香族氨基酸微环境发生了改变，因此导致酶构象的改变。

图3 不同浓度的油菜蜂花粉多酚对胰脂肪酶的紫外-可见吸收光谱Fig.3 UV absorption spectra of pancreatic lipase with different concentrations of rape bee pollen polyphenols

2.4 油菜蜂花粉多酚对胰脂肪酶的荧光光谱

通过荧光猝灭实验分析油菜蜂花粉多酚与胰脂肪酶之间的相互作用，如图4 所示，随着油菜蜂花粉多酚质量浓度的升高，胰脂肪酶的荧光强度呈现出递降的趋势，同时荧光峰位从341 nm 红移到349 nm，说明油菜蜂花粉多酚使胰脂肪酶的构象发生了改变，即色氨酸、酪氨酸以及苯丙氨酸影响导致。

为进一步确定蜂花粉多酚对胰脂肪酶构象的影响，利用同步荧光光谱来判断氨基酸残基构象及其所处环境的变化。如图5A 和图5B 分别是Δλ=15 nm和Δλ=60 nm 时油菜蜂花粉多酚的加入对胰脂肪酶的影响。前者表示对胰脂肪酶中酪氨酸的光谱特性，后者则为色氨酸[30]。由图5 可知，酪氨酸残基的最大发射波长基本保持不变，而色氨酸残基的最大发射波长略有红移，表明多酚的加入导致胰脂肪酶的构象发生变化，从而降低了色氨酸残基所处环境的疏水性，使得胰脂肪酶内部结构发生改变，肽链的伸展程度随之增加[31]。范金波等[32-33]、张国文等[34]采用荧光光谱法分别研究了绿原酸、咖啡酸和白杨素与胰脂肪酶的相互作用。结果表明这三种多酚与胰脂肪酶的结合均通过改变酶的结构从而抑制胰脂肪酶活性，同时金属离子在一定程度上抑制了这种结合。此外绿原酸、咖啡酸和白杨素均通过静态猝灭方式猝灭胰脂肪酶的内源性荧光。

2.5 荧光猝灭机理和结合常数分析

为探究胰脂肪酶和油菜蜂花粉多酚的互作模式，实验比较了不同温度下Stern-Volmer 方程的变化曲线。分别测定298 K 和308 K 时胰脂肪酶的的荧光强度，据公式（2）绘制F0/F 对[Q]的关系图见图6A，并将由Stern-Volmer 曲线拟合得到的方程中各参数见表2。在荧光分析中，若已知猝灭为动态猝灭，则随温度升高，猝灭常数增大；若为静态猝灭，则减小[35]。由图6A 可知，直线斜率随着温度升高而减小，提示其结合过程为静态猝灭。另外在298 K时，蜂花粉多酚对胰脂肪酶的KSV为0.1000 mg/mL，而在308 K 时，KSV则为0.0743 mg/mL。当油菜蜂花粉多酚与胰脂肪酶的荧光猝灭主要为静态猝灭时，其猝灭规律符合公式（3）。

表2 不同温度下油菜蜂花粉多酚与胰脂肪酶相互作用的Stern-Volmer 方程和双对数曲线方程参数Table 2 Stern-Volmer equation and double logarithm curve equation parameters for the interaction between rape bee pollen polyphenols and pancreatic lipase at different temperatures

式中，F0为未加入猝灭剂时的荧光强度；F 为猝灭剂浓度等于[Q]时的荧光强度；KA为表观结合常数；n 为结合位点数。

以lg[（F0-F）/F]对lg[Q]作图，见图6B 及表2，结合图表可求得298 K 时的油菜蜂花粉多酚与胰脂肪酶的表观结合常数KA的值为0.0755 mg/mL（298 K），0.1718 mg/mL（308 K），结合位点常数n 值为1.0288（298 K），0.5993（308 K），说明油菜蜂花粉多酚与胰脂肪酶的结合位点在这两个温度下均仅有1 个。

3 结论

本文通过紫外-可见分光光度法和荧光光谱法探究油菜蜂花粉多酚对胰脂肪酶的抑制活性和相互作用过程，发现油菜蜂花粉多酚能以静态猝灭方式与胰脂肪酶结合，而且能对胰脂肪酶的活性产生一定的抑制作用，引起酶活性降低50%时多酚的质量浓度为1.670±0.045 mg/mL，抑制类型为可逆性混合型抑制。此外，根据同步荧光光谱结果显示，随着油菜蜂花粉多酚的加入，胰脂肪酶中酪氨酸残基的最大发射波长基本保持不变，而色氨酸残基的最大发射波长略有红移，由此可见多酚的加入导致胰脂肪酶的构象发生了变化。Stern-Volmer 猝灭常数Ksv随着温度升高而减小，表明结合过程为静态猝灭，且结合位点约为1 个。综上所述，油菜蜂花粉多酚对胰脂肪酶存在明显抑制作用，多酚的存在可进一步阻碍膳食中脂肪的吸收，并使脂肪积累过程受到抑制。本实验也为蜂花粉多酚的降脂机制和进一步功能开发提供了理论依据，此外不同萃取方式得到的提取物及油菜蜂花粉多酚单体化合物对胰脂肪酶活性的抑制作用及二者的构效关系可作为后续研究的重点。