响应面优化高速剪切法制备薄荷挥发油包合物工艺

陈红斌，洪伦波,，汪 娟，徐建兵，杨小明，吴晓慧

（1.浙江惠松制药有限公司，浙江杭州 310020；2.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江 212013）

薄荷为唇形科植物薄荷（Mentha haplocalyxBriq.）的干燥地上部分，具有疏散风热、清利头目等作用[1]，被广泛应用于化妆品、医药和食品等领域。研究表明，薄荷挥发油的主要成分为薄荷醇和胡薄荷酮，它们具有较好的抗氧化和抗菌活性[2]。然而，由于薄荷油易挥发，在生产加工过程中损失严重，这降低了薄荷特有的香气和使用效果。

环糊精具有独特的疏水空腔结构，可以包合与其空腔大小相近的客体分子或其中的某些基团[3]，有研究表明β-CD 的包合作用对芳香化合物起到控制释放的作用[4]。因此，采用β-环糊精增加薄荷挥发油的稳定性，提高了薄荷油的利用度。当前，大多数研究资料采用饱和水溶液搅拌法和真空干燥法制备挥发油包合物[5]。例如，徐蓉蓉等[6]采用饱和水溶液法制备薏苡仁油β-环糊精（β-CD）包合物；马君义等[7]采用水溶液搅拌法制备百里香挥发油包合物；陆宁等[8]采用水溶液搅拌法制备薄荷油β-环状糊精包合物。搅拌法的包合时间较长，如Xi 等[9]采用搅拌法研究了肉豆蔻精油，最优包合时间为247 min。此外，有用超声法包合挥发油。如陈秋实等[10]研究了用超声处理方法包合薄荷挥发油；Jiang 等[11]采用超声法研究了茶树油的包合工艺，最优包合时间为70 min。超声法包合载药量也不高，如石春韬等[12]采用超声波制备肉桂-β-环糊精纳米微胶囊，载药量为7.05%。另外，有研究利用高压均质法来制备白术挥发油包合物[13]，但高速剪切机操作更方便，机器及安装成本更低，高速剪切法通常只需几分钟，可以节省包合时间，因此本文尝试选择高速剪切法来包合挥发油。

目前，大部分研究采用真空干燥法来干燥包合物，如王鸿森等[13]考察了白术挥发油β-环糊精包合物的制备工艺，最大收率为75.46%。真空干燥法制备需经过冷藏、抽滤、洗涤和干燥等繁琐复杂的工序，损失较多，收率不高，所以本文尝试用冷冻干燥法来制备包合物，省去过滤等工序，有助于提高收率。相较于其他方法，利用高速剪切法结合冷冻干燥法制备挥发油包合物的报道较少。

因此，本文采用高速剪切和冷冻干燥的工艺来制备薄荷油包合物。根据文献资料及单因素实验表明，包合工艺中的各因素可能存在交互影响[3]。如温度的升高可增加β-CD 的溶解性，从而提高包合率，但温度升高也使挥发油更容易挥发。另外，加入更多的β-CD 会增加包合几率，但过多的加入β-CD 也会使得包合物载油量降低。为了优化包合工艺，本文运用Box-Behnken 响应面法优化工艺。为了验证包合效果，本文利用高效液相色谱法（HPLC）检测包合物中的胡薄荷酮含量，并利用FTIR 对包合物进行表征，研究对薄荷油包合物的制备有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

薄荷 产自江苏，浙江惠松制药有限公司，惠远医药（浙江）有限公司药材饮片部鉴定为唇形科植物薄荷的干燥地上部分；β-环糊精（β-CD）医药级，曲阜天利药用辅料有限公司；胡薄荷酮对照品 批号：111706-201907，中国食品药品检定研究院；甲醇色谱级，Scharlab 公司；纯净水 娃哈哈集团有限公司；AL204 电子分析天平 梅特勒托力多仪器（上海）有限公司；TSC-E 电子台秤 索沃电子秤有限公司；OSC-10L 多功能搅拌器 群安实验仪器有限公司；HH-6 数显恒温水浴锅 常州市江南实验仪器厂；ZD25 高速剪切机 卓的仪器设备有限公司；DHG-9070A 电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；TC-15 恒温电热套 海宁华星实验仪器有限公司；TD-100 微型提取浓缩机组 浙江森力机械科技有限公司；FZG-2 真空干燥箱 南京康方机械科技有限公司；Agilent 1290 高效液相色谱仪美国Agilent 公司；Thermo-Nicolet iS5 傅里叶变换红外光谱仪 美国Thermo 公司；LGJ-100F 真空冷冻干燥机 北京松源华兴科技发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 薄荷挥发油包合物制备工艺 薄荷挥发油的提取：取薄荷饮片4 kg，投入提取罐中，加入10 倍量的水，保持微沸状态水蒸气蒸馏，提取至挥发油不再流出，得到油水混合物。将得到的油水混合物放入4 ℃冷藏库内放置24 h，使油水自然分层，分离回收挥发油层，即得。

β-CD 包合物的制备方法：称取一定量的β-CD，加入一定量的纯化水中，加热至一定的温度，保温，备用。将制备好的β-CD 饱和水溶液置于恒温水浴锅内，将薄荷挥发油溶液缓慢滴入β-CD 溶液中，待挥发油全部加入后开始计时[14]，继续搅拌，或剪切至规定时间，于4 ℃冷藏24 h，置于冷冻干燥机内冷冻干燥5 h（冷冻温度-40 ℃，升华温度40 ℃）；或真空干燥（抽滤，无水乙醇洗涤3 次，置于真空干燥箱内于45 ℃干燥5 h）。

1.2.2 干燥方法的比较 按照1.2.1 方法配制样品，β-CD 质量分数为10%，β-CD 与挥发油比例为8:1，包合温度为50 ℃，剪切速度为8000 r/min，4 ℃冷置24 h，分别用冷冻干燥和真空干燥法干燥样品，分别做3 个平行样，测定含油率、包合率和收率。

1.2.3 高速剪切法与搅拌法对比 称取一定量的β-CD 分别加入纯化水中，使水溶液中β-CD 的质量分数为10%，加热至包合温度50 ℃，β-CD 与挥发油比例为8:1，分别用搅拌和高速剪切的两种方法制备包合物，边搅拌（边剪切）边加入薄荷油。搅拌转速分别为500、800、1000 r/min，搅拌法分别搅拌3 h；应用高速剪切机的一档、二档、三挡速度分别对应剪切速度分别为8000、13000、18000 r/min，剪切法分别剪切1 min；按照1.2.1 的制备方法制备薄荷挥发油包合物，冷冻干燥（-40 ℃时冷冻5 h，然后升温到40 ℃），分别做3 个平行样，测定挥发油包合率及包合物含油率。

1.2.4 单因素实验

1.2.4.1 冷置时间对包合的影响 按照1.2.1 方法配制样品，β-CD 质量分数为10%，β-CD 与挥发油比例为8:1 g/mL，包合温度为50 ℃，剪切速度为8000 r/min，4 ℃冷置6、12、24、36 和72 h，冷冻干燥，重复实验（n=5），测定包合物含油量和包合率。

1.2.4.2β-CD 与挥发油比例的影响 按照相同方法配制样品，β-CD 质量分数为10%，包合温度50 ℃，剪切速度为8000 r/min，β-CD 与挥发油比例分别为3:1、6:1、9:1、12:1、15:1 g/mL，放置冷却24 h，冷冻干燥，重复实验（n=5），测定包合物含油量和包合率。

1.2.4.3 包合温度的影响 按照相同方法配制样品，β-CD 质量分数为10%，β-CD 与挥发油比例为8:1 g/mL，剪切速度为8000 r/min，包合温度分别为45、50、55、60 和65 ℃，放置冷却24 h，冷冻干燥，重复实验（n=5），测定包合物含油量和包合率。

1.2.4.4β-CD 的质量分数的影响 按照相同方法配制样品，β-CD 与挥发油比例为8:1 g/mL，包合温度为55 ℃，剪切速度为8000 r/min，水溶液中β-CD 的质量分数为5%、10%、15%、20%、25%、30%，放置冷却24 h，冷冻干燥，重复实验（n=5），测定包合物含油量和包合率。

1.2.5 响应面优化试验 响应面试验因素采用高速剪切法和冷冻干燥法制备包合物；在单因素实验基础上，选取对挥发油包合率和包合物含油率影响较大的3 个因素，即β-CD 与挥发油比例（因素A）、包合温度（因素B）、β-CD 质量分数（因素C），采用3 因素3 水平的响应面分析法进行试验设计，因素水平编码见表1。

表1 Box-Behnken 响应面法因素水平Table 1 Factors and levels for Box-Behnken response surface method

1.2.6 含油率及包合率的测定 称取一定量的包合物置于500 mL 圆底烧瓶中，加蒸馏水200 mL，按照《中国药典》（2020 版四部）通则中“挥发油测定法”项下甲法测定包合物中挥发油的含量[15]。空白回收率和包合率参考屈云萍等[16]的研究方法，收率参考高杰等[17]的研究方法，含油率根据实验需求计算包合物载药量所得公式。

1.2.7 综合评价指标 以挥发油包合率和包合物含油率的综合评分为考察指标[18-19]，因包合物含油率数值相差较小，所以选择含油率和包合率两个指标的权重为2:8，即

1.2.8 高效液相色谱法测定胡薄荷酮含量 色谱条件：色谱柱：CORTECS T3；柱温：40 ℃；检测波长：240 nm；流速：0.35 mL/min，流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸（B）；梯度洗脱条件：0～5 min，10% A→25% A；5～9 min，25% A→33% A；9～14 min，33%；14～22.5 min，33% A→50% A；22.5～26 min，50% A→95% A；26～27 min，95% A；27～30 min，95% A→10% A。

标准品溶液制备：取胡薄荷酮对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1 mL 含50 μg 的溶液，即得。

供试品溶液制备：取薄荷油适量，取约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得薄荷油供试品。取包合物样品适量，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20 mL，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，立即取出样品3000 r/min离心10 min，取上清液，滤过，取续滤液，即得包合物供试品。

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

1.2.9 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析 取约200 mg溴化钾（KBr）置于玛瑙乳钵中研成极细粉末，转移至专用模具中压成透明KBr 薄片，将薄荷挥发油1 滴滴于KBr 薄片上[20-21]；取β-CD 或包合物适量，加入适量的KBr 混合均匀，压制成片；取混合物（β-CD 和薄荷挥发油按照10:1 的比例，搅拌混合均匀），加入适量的KBr 混合均匀，压制成片；在500～4000 cm-1间范围内扫描红外光谱。设定红外光谱分辨率为0.741 cm-1，扫描信号累加32 次。

1.3 数据处理

每组试验做3～5 组平行，采用Origin 2022 版软件进行图表绘制；利用SPSS 27.0 软件进行数据统计分析，采取方差分析（ANOVA），P<0.05 表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著；通过Design-Expert 11 软件进行试验设计，对综合评分结果进行二次多元回归拟合和方差分析。

2 结果与分析

2.1 干燥方法的比较

由于用真空干燥法需要抽滤、无水乙醇洗涤，工序多、损失较多；而冷冻干燥法则无需抽滤、洗涤，减少了工序，对比两种干燥方法得出含油率、包合率和收率如表2 所示，结果可见两种干燥方法对包合率和含油率影响不大，但由于用真空干燥法需要抽滤、无水乙醇洗涤的步骤，工序较多损失较多，收率较低；而冻干法制备包合物的工序少、收率较高，一般在97%以上，优势比较明显，因此，本文选择冷冻干燥进行后续实验。

表2 真空干燥和冷冻干燥工艺的对比Table 2 Comparison of vacuum drying and freeze-drying process

2.2 高速剪切法与搅拌法对比结果

搅拌法包合挥发油通常需要3～6 h，预估高速剪切可以快速将挥发油挤压进入β-环糊精的空腔，为了提高挥发油包合物的生产效率，选择高速剪切法与常用的搅拌法对比，结果如表3 所示，搅拌法包合率与文献[6]中包合率63%接近。应用高速剪切法制备挥发油包合物时，剪切速度在8000 r/min 以上，高速剪切法制备的含油率和包合率较高，与搅拌法相比分别高出约3%和19%。由此可见高速剪切法在结果上优于搅拌法，剪切法用时1 min，节省时间并且操作和清洗简单。因此，本文选择高速剪切法进行后续实验。

表3 搅拌和剪切工艺的对比Table 3 Comparison of stirring and shearing process

2.3 单因素实验结果

冷置时间对包合的影响如图1a 所示，随着冷置时间增长包合物含油率和挥发油包合率都增大，可能是当温度降低，使得包合物沉淀后更稳定。当冷藏时间到达24 h，β-CD 含油率为10.25%，挥发油包合率为86.02%，冷藏时间继续增大到36 h，β-CD 含油率为10.61%，变化不显著，挥发油包合率为87.27%，增加缓慢，考虑时间成本，因此在之后的实验中冷置时间皆为24 h。

图1 各因素对含油率和包合率的影响Fig.1 Effects of various factorson responses of inclusion process

β-CD 与挥发油比例的影响如图1b 所示，随着β-CD 与挥发油比例增大，β-CD 的含油量先升高后降低，当其比例达到9:1 时，β-CD 的含油量达到最大为10.90%，之后比例继续增大，含油量开始下降；随着β-CD 与挥发油比例的增大，挥发油包合率先快速增加，比例增大到9:1 时，挥发油包合率为96.48%，之后包合率则不再有显著变化，其原因可能是β-CD 分子空腔有限，前期随着β-CD 的量增加，包埋量增大，形成包合物几率增大，含油率增高，但β-CD 用量过大时，大量的β-CD 未参与反应[22]。所以选择9:1 为响应面因素比例的中心点。

包合温度的影响如图1c 所示，随着包合温度的升高，含油率和包合率都先升高再降低，该趋势与文献结果一致[17,23]。之后开始当包合温度为55 ℃时，挥发油包合率最大为93.69%，之后随着包合温度的升高，挥发油包合率开始迅速下降，表明高于55 ℃，薄荷挥发油非常容易挥发，从而使包合率迅速下降。当包合温度为55 ℃时，β-CD 的含油率达到最大为11.48%，之后随着包合温度的升高，β-CD 的含油率快速降低。温度的升高，有助于更多的β-CD 溶解于水中而发挥作用[22]，提高β-CD 的含油率，达到55 ℃注：a：冷藏时间；b：β-CD 与挥发油比例；c：包合温度；d：β-CD 百分含量；不同小写字母表示各组含油量差异极显著（P<0.01），不同大写字母表示各组包合率差异极显著（P<0.01）。后，温度继续升高，挥发油则更快速地挥发，导致β-CD 含油率也开始下降。综上所述，选择55 ℃为响应面因素包合温度的中心点。

β-CD 的质量分数的影响如图1d 所示，β-CD的百分含量对包合工艺也有明显影响，随着水溶液中β-CD 百分含量的增加，含油率和包合率先增大后降低，该趋势与文献[17]研究结果一致。当β-CD 的百分含量增加至15%时，β-CD 含油量和挥发油包合率最大，分别为11.82%和94.57%。当β-CD 的百分含量继续增加时，包合物含油率和挥发油包合率开始降低。说明在一定的温度和剪切速度下，β-CD 的百分含量超过15%后，继续增加β-CD 用量会对其在水中的溶解造成影响，从而使得含油率和包合率开始下降。包合方法和条件不同，评分最佳的β-CD 含量有差异[17,23]。本实验选择15%为响应面因素β-CD 质量分数的中心点。

2.4 响应面试验结果

2.4.1 多元二次模型方程的建立及方差分析 Box-Behnken 实验设计及结果见表4，回归模型和方差分析见表5。采用Design-Expert11 软件对综合评分结果进行二次元多元回归拟合，回归方程：Y=98.02+6.37A-1.09B+9.76C+2.61AB+0.5746AC-0.1712BC-15.15A2-16.09B2-9.48C2，决定系数R2=0.9984，校正系数为R2Adj=0.9964。对该模型进行方差分析，结果见表5，P<0.0001，说明二次多元回归模型极显著；失拟项不显著（P>0.05），说明试验误差小，可信度高，该方程对模拟真实的三因素三水平的分析是可行的。

表4 Box-Behnken 试验设计与结果Table 4 Design and results of Box-Behnken

表5 回归模型和方差分析Table 5 Regression model and analysis of Variance

由方差分析结果可以看出，一次项A（P<0.01）和C（P<0.01），二次项A2和C2（P<0.01）均在1%的水平内极显著，表明在工艺过程中，β-CD 与挥发油比例和β-CD 的百分含量对包合工艺有极其显著的影响。一次项B（P<0.05）和二次项B2（P<0.01）表明温度对包合工艺有显著性影响。

交互项AB（P<0.01）在1%的水平内显著（极显著），AC（P>0.05）和BC（P>0.05）的交互作用对包合工艺影响不显著。从图2 的响应面弯曲度和等高线图可以看出，AB 交互作用图形可以看出，AB 交互作用的响应面坡度较为陡峭，等高线较为密集，AB 交互作用对包合工艺综合评分影响显著。AC 和BC交互作用响应面较为缓平，等高线较为稀疏，因此AC 和BC 交互作用对包合工艺影响不显著，与方差分析结果一致。由图2 表明β-CD 与挥发油比例与包合温度对包合工艺的交互作用影响显著，将β-CD 与挥发油比例固定在9:1 g/mL 时，包合工艺的综合评分随着温度的升高先增加后降低，当温度达到55 ℃后，综合评分开始下降。温度大于55 ℃时，薄荷油会加速挥发，从而影响包合效果，降低了综合评分。在温度固定在55 ℃时，随着β-CD 与挥发油比例的增大，综合评分先升高后降低，比例达到数值9:1 g/mL 之后，综合评分开始下降，说明当β-CD 已经过饱和，继续增加比例会降低含油率，从而使综合评分下降。

图2 AB、AC、BC 两两因素交互对综合评分的影响的三维响应面图Fig.2 Response surfaces of effects of interaction of AB,AC,BC on scores

2.4.2 模型验证实验 利用Design-Expert11 软件分析给出最优工艺为β-CD 与挥发油比例为9.39:1（g/mL），包合温度55.09 ℃，β-CD 百分含量为17.00%，综合得分99.9。考虑工艺应用的方便性，工艺修正为β-CD 与挥发油比例为9:1（g/mL），包合温度55 ℃，β-CD 含量17%，在优选出的最佳工艺条件下进行验证实验（n=3），得到包合物含油率为10.9%，挥发油包合率为97.6%，综合得分为99.7，RSD 值为1.59%。因此，试验结果与模型预测值基本一致。

2.5 HPLC 测定胡薄荷酮的含量

如图3a 中为胡薄荷酮对照品的液相图谱，在薄荷油和包合物的液相图谱中均能找到胡薄荷酮的峰，在10～11 min 处，说明包合物中含有胡薄荷酮指标成分。如图3b 计算得出薄荷油中胡薄荷酮含量为20.518 mg/g。如图3c 所示，计算三批包合物中胡薄荷酮平均含量为2.465 mg/g，RSD 值为0.65%，证明包合物中含有薄荷油的特征成分，特征成分含量也较高。

图3 胡薄荷酮（a）、薄荷油（b）和包合物（c）的高效液相图谱Fig.3 HPLC chromatograms of Pulegone (a),volatile oil (b) and inclusion complex (c)

2.6 FTIR 对比分析包合物的表征

如图4 所示，3424 cm-1附近为O-H 伸缩振动吸收峰；2924 cm-1附近为亚甲基的C-H 非对称伸缩振动吸收峰[24]。

图4 薄荷油、β-CD 及两者包合物与混合物的红外光谱图Fig.4 FTIR spectra of volatile oil,β-CD and its inclusion complex and mixtures

薄荷油红外光谱中峰2957、2871 cm-1是-CH3中C-H 键非对称和对称振动所产生[25]；1736～1023 cm-1为饱和醇类、酯类特征峰[26]，本试验中这类特征峰归属于在挥发油[27]。1736 cm-1为芳香酸酯类中C=O伸缩振动吸收峰，1710 cm-1为酮类化合物中C=O伸缩振动，1643 和1456 cm-1为芳环C=C 的拉伸振动[28]；1244 cm-1为饱和酯盐的C-O 拉伸振动[26]；1048 和1023 cm-1为饱和醇类物质中C-O 伸缩振动吸收峰[29]。

β-CD 红外光谱峰值3424 cm-1归于O-H 伸缩振动，2927 cm-1归于C-H 伸缩振动，1157 cm-1归于C-O 伸缩振动[29]。1500～1000 cm-1归因于C-O和C-O-C 键的不对称拉伸振动，β-CD 红外指纹带归因于β-CD 的葡萄糖链状结构[30]。

混合物的典型峰值与β-CD 和薄荷油红外峰值重叠，在β-CD 和薄荷油的光谱中均可以找到，只是伸缩振动的峰的强度减弱，然而，没有显著差异，表明挥发油和环糊精没有发生相互作用。混合物与包合物的红外峰值存在差别，如在2952、2871 和1710 cm-1处，表明β-CD 与薄荷油的简单混匀物与包合物存在结构上的差异，表明包合物形成了新的结构。

薄荷油红外光谱信息复杂，而被β-CD 包合后，复杂的光谱信息消失，因此包合物与β-CD 红外光谱类似。在包合物红外光谱中，挥发油在2957、2871、1736、1456 和1048 cm-1处的特征峰消失了；710、1367 cm-1处吸收峰减弱。说明了基团被包进了β-CD 的空腔，一个新的包合物形成了。一旦客体分子进入了β-CD 的空腔，它就会产生限制，减少其伸缩振动，并削弱典型的峰值[29]。与β-CD 红外光谱相比，包合物的红外光谱在1710 cm-1产生新峰；在3374 cm-1有明显的偏移；在1411、1367、1330、1157、1076、1026、944 cm-1特征峰强度更大，表明包合物与β-CD 是不同的物相[31]。

3 结论

本实验采用高速剪切法和冷冻干燥法制备薄荷油β-CD 包合物，实验证明高速剪切法比搅拌法效率高，含油率和包合率都相对较高；冷冻干燥法工序简单且收率高，平均收率为97.6%。通过单因素和响应面实验，优化了薄荷挥发油的包合工艺，得出最优的包合工艺修正为：β-CD 与挥发油比例为9:1（g/mL），包合温度55 ℃，β-CD 含量17%，得到包合物含油率为10.9%，挥发油包合率为97.6%；综合得分为99.7，RSD 值为1.59%。因此，试验结果与模型预测值基本一致。包合物用HPLC 测得胡薄荷酮含量为2.465 mg/g；采用FTIR 分析证明了包合物新物相的形成；证明了包合方法可靠，对于挥发油包合的工艺有一定指导作用。