三丁酸甘油酯对沙门氏菌感染文昌鸡所致肝脏盲肠损伤的影响

韦泽晶 师丽敏 雷湘兰 易新 杨琛

(海南职业技术学院，海南 海口 570216)

前言

鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pullorum，SP)是一种兼性厌氧菌，革兰氏染色呈阴性，其大小为0.5～1.6μm×1.9～5.0μm，形态圆钝，形状短小，无荚膜和芽孢。鸡白痢沙门氏菌感染分为3个阶段，沙门氏菌浸入肠道，通过肠道感染后，通过菌毛附着于肠粘膜上导致盲肠病变；巨噬细胞包裹着沙门氏菌转移至组织器官(肝脏、脾脏和卵巢等)；沙门氏菌在肝脏和脾脏大量复制导致肝脏、脾脏肿大，形成病变。雏鸡感染可表现为高致病性，临床症状表现为食欲减少，精神萎靡，排白色粪便，并伴有糊肛现象。急性型感染可致雏鸡死亡，病理学可见心包内有渗出物，心肌组织内肉芽肿，肝脏表现出白色病灶或局部坏死，胆囊肿大等，蛋鸡感染后可导致卵巢和卵泡损伤变形[1]。

三丁酸甘油酯(Tributyrate，TB)又称甘油三丁酸酯，其不可被胃酸溶解，可被胰脂肪酶分解产生3分子丁酸和1分子甘油，正常肠上皮细胞的70%的能量均由丁酸提供[2]，TB分解后通过血液循环系统运输至机体各组织器官发挥作用。饲粮添加TB可促进动物肠道发育，提高动物的免疫力，改善动物的生长性能，保障动物机体的健康。有研究表明，高浓度的丁酸可抑制细胞增殖并促进凋亡，低浓度的丁酸可促进肠上皮细胞的生长和增殖[3]。此外，丁酸可在线粒体中发生β-氧化同时释放大量能量，使得肠道环境酸化，阻止病原菌的增殖，因此TB可作为替抗备选药物。由于规模化养殖，滥用抗生素引起的畜产品安全的案例屡见不鲜，故无毒、安全、绿色的饲料添加剂来替代抗生素显得十分重要。目前，国内外对TB和沙门氏菌的单独研究较多，而TB在对沙门氏菌引起的肝脏影响知之甚少，因此，通过研究探讨三丁酸甘油酯对沙门氏菌感染文昌鸡肝脏及盲肠损伤的影响，为提高三丁酸甘油酯高效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

随机将200只质量相近、体况健康的1日龄雏鸡分为对照组(Con组)、三丁酸甘油酯组(TB组)、鸡白痢沙门氏菌组(SP组)和沙门氏菌加三丁酸甘油酯组(SP+TB组)，每组5个重复，每个重复10只。Con组给予基础饲料，TB组和SP+TB组在基础饲料中添加500mg·kg-1的三丁酸甘油酯，饲养7d时，SP组和SP+TB组每只鸡口服1mL鸡白痢沙门氏菌(1×109CFU/只)，试验期为21d。分笼常规饲养，自由采食、饮水，并每周采集体重信息。基础饲料其成分及营养水平见表1。

表1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础)

1.2 样品的采集

于试验21d进行采样，以重复为单位取2只鸡。采样前12h禁水、禁食，翅静脉采集10mL血液，并离心取血清用于生化指标的检测。安乐死后，立即取出肝脏和盲肠组织，将一部分样品置于4%多聚甲醛固定液中用于HE染色；另一部分组织于超低温冰箱保存，用于凋亡和炎症因子相关mRNA相对表达量的检测。

1.3 生化指标的测定

血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的测定根据试剂盒说明书进行操作，试剂盒为南京建成科技有限公司生产。

1.4 肝脏组HE染色

参照Cheng G等[10]方法制备。

1.5 凋亡和炎症相关mRNA相对表达量的检测

1.5.1 引物与探针设计

鸡转录基因序列从NCBI的基因库中获取，用Primer express 3.0软件进行引物和探针设计，引物和探针序列见表2，由擎科生物科技有限公司合成。

表2 凋亡和炎症相关mRNA引物和探针序列

1.5.2 肝脏组织RNA提取

使用Trizol法，根据TaKaRa试剂盒的说明书进行总RAN的提取。并使用核酸浓度仪测定RNA浓度。

1.5.3 基因组DNA的去除和反转录

根据TaKaRa说明书进行操作，将已知RNA的浓度稀释为1000ng用于反转录。

1.5.4 RT-qPCR反应

鸡肝脏中的基因用TaqMan RT-qPCRT法进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)反应。每组分别取20个样品，每个样品设定3个重复，进行实时荧光定量PCR扩增。扩增程序：50℃2min，95℃min，40个循环，95℃ 15s，60℃ 1min。

1.6 数据分析

使用SPSS 17.0对数据进行分析，并用Duncans进行组间比较差异性显著，最后用Prism 5.0软件对试验数据作柱状图。试验结果数据均用“平均值±标准误差”表示。

2 结果与分析

2.1 三丁酸甘油酯对鸡白痢沙门氏菌导致肝脏生化指标的影响

三丁酸甘油酯对鸡白痢沙门氏菌导致肝脏生化指标的影响见图1。与Con组相比，TB组有下降趋势，但无显著性差异(P>0.05)；与Con组相比，SP组和SP+TB组的ALT和AST的活性显著升高(P<0.05或P<0.001)，而SP+TB组与SP组相比，ALT和AST的活性有显著下降趋势(P<0.05)。

图1 三丁酸甘油酯对鸡白痢沙门氏菌导致肝脏生化指标的影响

2.2 三丁酸甘油酯对鸡白痢沙门氏菌导致肝脏炎症因子相关基因mRNA表达的影响

三丁酸甘油酯对鸡白痢沙门氏菌导致肝脏炎症因子相关基因mRNA表达的影响如图2所示。与Con组相比，TB组有下降趋势，但无显著性差异(P>0.05)；SP组和SP+TB组与Con组相比，IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达水平显著升高(P<0.05，P<0.01或P<0.001)；SP+TB组与SP组相比上述炎症因子mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。

图2 三丁酸甘油酯对鸡白痢沙门氏菌导致肝脏炎症因子相关基因mRNA表达的影响

2.3 三丁酸甘油酯对鸡白痢沙门氏菌导致肝脏凋亡相关基因mRNA表达的影响

三丁酸甘油酯对沙门氏菌导致肝脏凋亡相关基因mRNA表达的影响，如图3所示。与Con组相比，TB组有下降趋势，但无显著性差异(P>0.05)；相比于Con组，SP组和SP+TB组的Caspase-9、Caspase-3和Bax的mRAN的表达量极显著上升(P<0.001)；SP+TB组与SP组相比，Caspase-9、Caspase-3和Bax的mRAN的表达量显著下降(P<0.001)。

图3 三丁酸甘油酯对鸡白痢沙门氏菌导致肝脏凋亡相关基因mRNA表达的影响

2.4 三丁酸甘油酯对鸡白痢沙门氏菌导致肝损伤的影响

三丁酸甘油酯对鸡白痢沙门氏菌导致肝损伤的影响见图4。Con组和TB组：肝细胞饱满、圆润，排列整齐，肝窦无明显扩张或挤压；无明显的炎性变化，见图4a、图4b。SP组：肝脏出现大量的血管周围淋巴细胞灶性浸润，见图4c。SP+TB组：肝细胞空泡变性；局部血管周围可见淋巴细胞灶性浸润，少见淤血见图4d，相较于SP组有明显的改善情况。如图4e盲肠HE染色结果显示，Con组和TB组盲肠绒毛正常，无淋巴细胞浸润；而图4g、图4h黏膜层有大量淋巴细胞浸润，肠绒毛缩短，图4h与图4g相比，黏膜层淋巴细胞减少。

注：a～d肝脏×13；e～h盲肠×13。图4 三丁酸甘油酯对鸡白痢沙门氏菌导致肝脏及盲肠损伤的影响

2.5 三丁酸甘油酯对沙门氏菌感染文昌鸡生长性能的影响

三丁酸甘油酯对沙门氏菌感染文昌鸡生长性能的影响如表3所示。与Con组相比，TB组显著提高了料重比(P<0.01)，SP组料重比显著降低(P<0.001)；SP+TB组与SP组相比料重比显著提高(P<0.001)。

表3 三丁酸甘油酯对沙门氏菌感染文昌鸡生长性能的影响

3 讨论

肝细胞的胞质中存在大量ALT，而AST主要存在于心肌中，其次是肝脏。当肝细胞坏死或受损时，ALT和AST通过细胞膜进入血液，导致血清中ALT、AST的含量显著上升，因此血清中ALT和AST含量是反映肝组织的损伤程度的指标之一。在SP的感染下，鸡血清中ALT和AST的含量极显著升高，说明SP可导致肝脏损伤[4]。黄夕瑶[5]研究显示，鼠伤寒沙门氏菌刺激肝细胞释放ALT，并在染毒24h后含量达到峰值。曾静静[1]研究表明，在鸭沙门氏菌的感染下雏鸭血清中ALT和AST含量显著升高，造成了鸭肝脏损伤。本试验结果显示，SP+TB组和SP组的ALT和AST的含量均显著高于Con组，与黄夕瑶、曾静静研究结果一致，而SP+TB组与SP组相比ALT和AST的含量显著下降，说明TB能够减轻SP导致的肝损伤。机体先天免疫细胞表达受体系统能够在细胞表面及内体膜上的Toll样受体(toll like receptors，TLRs)识别细胞外的微生物，并引发快速防御和迟发细胞反应，激活多种宿主防御信号通路。Toll样受体下游的NFκB和IRF途径可诱导促炎性细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。IL-1β是IL-1家族中的重要成员，其在炎症相关疾病中的重要作用。IL-1β具有较强的促炎活性，可诱导多种促炎介质，如细胞因子和趋化因子，并最终导致扩大炎症反应。此外，IL-1β的局部激活是促炎反应的中心环节，可导致继发性炎症介质(包括IL-6)的激活。TNF-α与IL-1β相似，是一种多效性促炎细胞因子，属于TNF家族。TNF-α在调节发育和免疫过程中发挥着不同的作用，包括炎症、分化、脂质代谢和凋亡，与多种疾病有关[6]。IL-17、IL-1β和IL-6共同参与NF-κB的活化过程，NF-κB能调控分泌次级炎症介质的酶，直接导致炎症的典型症状。IFN-γ是可溶性二聚体细胞因子，是II型干扰素的唯一成员，IFN-γ过度激活会引起组织损伤、坏死和炎症[7]。曾静静[1]研究显示，鸭感染沙门氏菌后肝脏中IFN-γ的mRNA表达量显著升高，肝脏变现出血和大量炎性细胞增生。高晗[8]研究表明，在沙门氏菌感染下鸡肝组织IL-6、IL-17和TNF-α表达水平的升高，应用丁酸梭菌后减轻鸡白痢沙门氏菌对绿壳蛋鸡肝脏，脾脏组织的病变程度。本试验结果显示，与Con组相比，SP组和SP+TB组的IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α和IFN-γ的mRNA表达水平显著升高，SP+TB组与SP组相比，Caspase-9、Caspase-3和Bax的mRAN的表达量显著下降，此结果与上述研究结果一致，说明SP能够引起导致鸡肝脏和盲肠组织发生损伤和炎症反应，而TB能够减缓SP导致的鸡肝组织反应。

细胞凋亡是细胞死亡的一种形式，细胞凋亡也称程序性死亡。在肝组织的病变中凋亡起着重要作用。大量研究表明，急、慢性肝损伤的主要原因是死亡受体通路的紊乱而引起。凋亡主要特征为线粒体膜电位降低，线粒体嵴断裂[9]。由线粒体途径引起的凋亡途径机制：Bax促凋亡因子活化转移至线粒体外膜形成蛋白性孔道，改变线粒体膜通透性，释放细胞色素C[10]。细胞色素C能够调节促凋亡基因Caspase家族。细胞色素C的大量释放能够激活上游基因p-Caspase-9，使其具有活性的Caspase-9，Caspase-9剪切执行凋亡基因Caspase-3使其活化，最终导致细胞发生凋亡[11]。Schwabe等[12]研究显示，细胞凋亡与肝损伤的发病机制密切相关，如肝硬化、病毒性肝炎。Takayashiki等[13]报道，发生乙醇性肝损伤时，部分肝细胞以凋亡的方式被清除，说明损伤的肝细胞与凋亡有关；黄夕瑶[5]研究表明，鼠伤寒沙门氏菌刺激后雏鸡肝脏的Caspase-3和Bax mRNA的表达量显著升高，通过HE染色发现肝窦扩张明显，门管区出现炎性细胞，肝细胞中出现较大的空泡，胞浆散布于空泡之间。ChuanYu等[14]研究显示，在鼠沙门氏菌感染巨噬细胞下，巨噬细胞Caspase-9和Caspase-3的mRNA表达水平显著升高，并发生凋亡。本研究表明，SP激活了凋亡通路的死亡受体，从而启动凋亡程序，导致Caspase-9、Caspase-3和Bax的表达水平显著升高导致细胞凋亡。SP+TB组与SP组相比表达水平显著降低，说明TB能够减轻SP导致的鸡肝细胞发生凋亡。同时HE染色发现SP组肝脏出现多量的血管周围淋巴细胞灶性浸润和血管淤血；SP+TB组出现肝细胞空泡变性，胞质内可见体积微小的圆形空泡；局部血管周围可见淋巴细胞灶性浸润，未出现淤血，相较于SP组有明显的改善。SP组盲肠的黏膜层出现大量淋巴细胞浸润，而SP+TB组较SP组淋巴细胞浸润显著降低。此外，在生长性能上，与Con组相比TB组能够显著提高文昌鸡料重比，而SP组的料重比显著降低；SP+TB组与SP组相比料重比显著提高。

综上所述，鸡白痢沙门氏菌能够导致鸡肝细胞发生损伤和炎症反应，而应用TB可减轻肝细胞发生损伤和炎症反应并提高文昌鸡的生长性能。