甘蔗梢腐病的室内杀菌剂筛选

陈潇航 王泽平 黄海荣 张小秋 宋修鹏 李文教 雷敬超 黄冬梅 李秋芳 颜梅新

摘 要：为明确不同杀菌剂对甘蔗梢腐病病原菌的抑菌效果以便后续科学地指导病害防治，本文分别使用42.4%唑醚·氟酰胺悬浮剂，62.5 g/L精甲·咯菌腈悬浮种衣剂，250 g/L苯醚甲环唑乳油，325 g/L苯甲·嘧菌酯悬浮剂，25%吡唑醚菌酯乳油，43%氟菌·肟菌酯悬浮剂，60%唑醚·代森联水分散粒剂和19%啶氧·丙环唑悬浮剂对甘蔗梢腐病病原菌拟轮枝镰孢菌（Fusarium verticillioides）采用菌丝生长速率法进行室内药剂筛选，并通过扫描电镜（SEM）观测不同杀菌剂对病原菌孢子与菌丝的影响。结果表明，不同杀菌剂对病原菌菌丝生长均有一定抑制作用。扫描电镜结果表明，经不同杀菌剂处理后，病原菌孢子和菌丝均有不同程度的溃烂、畸形、干瘪甚至穿孔。其中，19%啶氧·丙环唑悬浮剂和325 g/L苯甲·嘧菌酯悬浮剂的抑菌效果较好，抑制中浓度（EC50）分别为0.260 μg/mL和0.042 μg/mL；而62.5 g/L精甲·咯菌腈悬浮种衣剂的抑菌效果较差，EC50高達2504.060 μg/mL。供试药剂中，三唑类杀菌剂与甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的复配剂抑菌效果最好，其EC50均小于1.000 μg/mL。

关键词：甘蔗梢腐病；拟轮枝镰孢菌；杀菌剂筛选

中图分类号：S566.1                              文献标识码：A   文章编号：2095-820X（2023）02-0019-06

0 引言

甘蔗种植是广西重要的支柱产业，广西甘蔗产量占全国总产量的65%以上［1］。甘蔗梢腐病是重要的甘蔗真菌病害之一，广泛发生于广东、广西、云南、福建等主要甘蔗产区。甘蔗梢腐病对甘蔗的产量及品质造成巨大危害，可使受害甘蔗减产40%～60%，糖分降低40.8%～64.5%［2］，甘蔗梢腐病已成为糖业发展的重要障碍之一。甘蔗梢腐病于1896年由Walker和Went首次在爪哇发现［3］，迄今为止，世界各个甘蔗种植区域均有记载甘蔗梢腐病发生。3至7个月大的甘蔗苗最易感染甘蔗梢腐病［4］，感染初期甘蔗叶片出现皱缩、卷曲、缩短等畸形［4， 5］，随后在叶片褪绿部上产生不规则的红色条纹或斑点［6］，叶鞘也可能褪绿并出现红色不规则坏死斑［7］。如果病原菌侵染局限在叶部，甘蔗通常能自行恢复，如果侵染至甘蔗顶端梢，会使顶端生长点畸形、溃烂，心叶部坏死，最终导致植株枯萎死亡［8］。

甘蔗梢腐病由镰刀菌复合体侵染致病，在不同甘蔗种植区域，主要致病菌有所不同。马来西亚蔗区梢腐病的主要致病菌为Fusarium moniliforme［9］，而南非蔗区主要致病菌为F.sacchari，F.proliferatum和F.andiyazi［10］，中国蔗区的致病菌则以F.verticillioides和 F.proliferatum为主［11］。

由于我国早期甘蔗种植管理粗放且对甘蔗病害的影响不够重视，因此在甘蔗育种中较少进行抗梢腐病品种的选育工作［12］。我国推广种植的甘蔗品种相对单一，且种植年限较长，这些推广品种都不同程度地受到甘蔗梢腐病的威胁［13］。然而选育出品质优良的抗梢腐病甘蔗新品种需要大量时间，并且新培育出的抗病品种也往往由于病原菌生理小种变异而在几年的大规模生产种植后抗性降低。因此寻找行之有效的药剂防治甘蔗梢腐病仍是解决燃眉之急的重要措施。

本研究对从广西蔗区梢腐病发病蔗株上分离到的梢腐病菌进行了8种杀菌剂的室内生物活性测定，通过分析不同杀菌剂对菌丝生长速率的影响，确定病原菌对不同杀菌剂的敏感程度，为生产中选择高效低毒的防控杀菌剂提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

供试菌株甘蔗梢腐病菌株拟轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）由广西农业科学院甘蔗研究所实验室保存提供。

1.1.2 供试杀菌剂及培养基

试验中使用的培养基为广东环凯生物马铃薯葡萄糖琼脂干粉培养基（PDA）。供试杀菌剂具体信息如表1所示。

1.2 室内生物活性测定

采用菌丝生长速率法［14］对拟轮枝镰孢菌进行室内杀菌剂筛选。先通过预试验确定各药剂抑制率在5%～95%之间的浓度范围后，使用无菌水把供试的杀菌剂配制成有效成分含量为100 μg/mL的母液，再根据表2用无菌水配制不同浓度梯度的药液。

用移液枪分别吸取1 mL药液混入49 mL 50 ℃左右的未凝固PDA培养基中，加入头孢菌素后混匀制成带药平板，以等量无菌水替代药剂加入PDA培养基制成的平板作为空白对照。将保存在4 ℃的病原菌菌株用接种针挑取小块带菌培养基块置于PDA培养基上培养7 d，用直径6 mm打孔器在菌落边缘幼嫩菌丝处打孔获取菌饼，分别置于对照平板与含药平板中央，每个处理3次重复。在28 ℃恒温培养箱培养7 d，使用十字交叉法测量菌落直径，计算菌落直径的平均值与菌丝生长抑制率。计算公式为：

菌丝生长抑制率=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径）×100%。

将各杀菌剂抑制率与对应浓度用SPSS 26软件进行数据处理，可以获得毒力方程，以及杀菌剂对甘蔗梢腐病菌的抑制中浓度（EC50）。

1.3 有效杀菌剂对甘蔗梢腐病菌的作用效果

以甘蔗梢腐病菌菌体（孢子和菌丝）作为测试对象，将保存在4 ℃的病原菌菌株用接种针挑取小块带菌培养基块置于PDA培养基上培养7 d，用10 mL无菌水将平板上的菌体洗脱，将菌体悬液加入有效中浓度对甘蔗梢腐病菌有抑制作用的杀菌剂，以不加药为对照，28 ℃，200 r/min下处理30 min；5000 r/min常温离心，去掉上清液，加入等体积电镜固定液FAA（甲醛、乙酸、乙醇，5∶5∶90）重悬浮。处理过的甘蔗梢腐病菌进行扫描电镜测试，扫描电镜方法参考Marques等［15］。

2 结果与分析

2.1 供试杀菌剂对菌丝生长的抑制作用

8种杀菌剂对甘蔗梢腐病菌菌丝的生长抑制效果如表3所示，19%啶氧·丙环唑、325 g/L苯甲·嘧菌酯和250 g/L苯醚甲环唑这3种杀菌剂的活性较强，EC50分别为0.042、0.260和1.090 μg/mL，均小于10.000 μg/mL。43%氟菌·肟菌酯、25%吡唑醚菌酯和60%唑醚·代森联的EC50分别为24.410、30.480和63.870 μg/mL，EC50在10.000～100.000 μg/mL范围内，抑菌活性次之。而42.4%唑醚·氟酰胺和62.5 g/L精甲·咯菌腈的EC50均大于100.000 μg/mL，表明这2种杀菌剂的抑菌活性最差。供试杀菌剂对病原菌的梯度抑制效果如图1所例。

2.2 供试杀菌剂不同作用类型特点对比

供试的2种单剂6种复配杀菌剂中共有6种不同作用类型的杀菌劑，根据杀菌剂的作用类型分类对比其EC50。由表4可知，三唑类杀菌剂表现出较强的抑菌活性，并且甲氧基丙烯酸酯类和三唑类复配药剂的抑菌活性更为突出，EC50均小于1.000 μg/mL。

2.3 杀菌剂对甘蔗梢腐病菌作用的电镜扫描分析

电镜扫描结果表明，对照中甘蔗梢腐病菌呈长柱形，表面较光滑（图2-A）。甘蔗梢腐病菌菌体经325 g/L苯甲·嘧菌酯悬浮剂处理后，孢子与菌丝表面粗糙溃烂、孢子畸形（图2-B）；经杀菌剂43%氟菌·肟菌酯悬浮剂处理后，孢子表面形成孔洞凹陷（图2-C）；经250 g/L苯醚甲环唑乳油处理后，孢子与菌丝组织呈腐烂状，孢子干瘪或畸形（图2-D）；经25%吡唑醚菌酯乳油处理后，孢子表面形成凹陷、畸形，菌丝表面溃烂、干瘪甚至穿孔（图2-E）；经19%啶氧·丙环唑悬浮剂处理后，孢子与菌丝表面溃烂（图2-F）。

3 讨论

本研究中以甘蔗梢腐病菌拟轮枝镰孢菌作为研究对象，采用菌丝生长速率法，测试了250 g/L 苯醚甲环唑乳油、25%吡唑醚菌酯乳油、19%啶氧·丙环唑悬浮剂、325 g/L苯甲·嘧菌酯悬浮剂、42.4%唑醚·氟酰胺悬浮剂、43%氟菌·肟菌酯悬浮剂、60%唑醚·代森联水分散粒剂和62.5 g/L精甲·咯菌腈悬浮种衣剂8种杀菌剂对拟轮枝镰孢菌的室内生物活性。检测结果表明8种杀菌剂对甘蔗梢腐病菌F. verticillioides均有明显抑制效果。19%啶氧·丙环唑悬浮剂的抑菌效果最好，是防治甘蔗梢腐病首选，其次为325 g/L苯甲·嘧菌酯悬浮剂和250 g/L苯醚甲环唑乳油，对甘蔗梢腐病菌也有较明显抑制作用。通过分析杀菌剂作用方式类型发现，三唑类杀菌剂250 g/L苯醚甲环唑乳油的抑菌活性显著，EC50可达1.090 μg/mL。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂和三唑类杀菌剂的复配药剂19%啶氧·丙环唑悬浮剂和325 g/L苯甲·嘧菌酯悬浮剂的抑菌活性远高于同类型杀菌剂单剂，分别达到0.042和0.260 μg/mL。而甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂与琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂的复配药剂表现出的抑菌活性差异较大，43%氟菌·肟菌酯悬浮剂的EC50为24.410 μg/mL，而42.4%唑醚·氟酰胺悬浮剂的EC50却高达507.680 μg/mL。综上所述，250 g/L苯醚甲环唑乳油作为三唑类杀菌剂对甘蔗梢腐病菌F. verticillioides的抑菌活性较出色，三唑类杀菌剂与甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的复配制剂抑菌活性更佳，本研究中复配药剂19%啶氧·丙环唑悬浮剂和325 g/L苯甲·嘧菌酯悬浮剂的防效最佳，EC50分别为0.042和0.260 μg/mL。

苯醚甲环唑属于三唑类杀菌剂，三唑类杀菌剂具有高效低毒、杀菌谱广、作用持久、对植物兼具保护和治疗作用等优点，20世纪70年代起逐渐成为全球使用最广泛的一类杀菌剂。三唑类杀菌剂主要通过影响病原菌麦角甾醇的合成路径，破坏病原菌的细胞膜的结构与功能，达到抑菌功效［16］。黄海娟等［17］研究表明三唑类杀菌剂的三唑酮对于拟轮枝镰孢菌有较强抑制作用，室内毒力EC50为2.672 mg/L，20 %三唑酮800倍液对甘蔗梢腐病的田间防治效果高于96%。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂是以嗜球果伞素A为先导化合物研发的微生物源仿生类杀菌剂。该类杀菌剂活性高、杀菌谱广，几乎对所有的真菌和卵菌类病害均有良好的防治效果。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的作用机理是通过与病原菌线粒体复合物Ⅲ辅酶Q的氧化位点（Qo）结合，阻断细胞色素b和c1之间的电子传递，进而干扰细胞三磷酸腺苷（ATP）的合成，使病原菌因能量不足而死亡［18］。李宇峰等［19］的研究表明，22.5%啶氧菌酯悬浮剂对梢腐病病原菌的菌丝生长有较好的抑制作用，室内毒力测定EC50为0.4699 mg/L。本研究扫描电镜结果表明，325 g/L苯甲·嘧菌酯悬浮剂，43%氟菌·肟菌酯悬浮剂，250 g/L苯醚甲环唑乳油，25%吡唑醚菌酯乳油和19%啶氧·丙环唑悬浮剂对甘蔗梢腐病菌菌丝和孢子造成不同程度的破坏，从而有效抑制病菌生长。

随着杀菌剂种类不断推陈出新，能够用于防治甘蔗梢腐病的杀菌剂种类将会越来越多，因此应是不断筛选不同作用机理的杀菌剂对甘蔗梢腐病进行防治。本研究仅对2种单剂、6种4类复配杀菌剂进行了室内筛选试验。但不同的药剂剂型以及同类作用机制杀菌剂的不同品种药剂的防治效果仍可能存在较大差异，因此应进一步确认同类杀菌剂中其他药剂或其他剂型对甘蔗梢腐病的防治效果。李苗等［20］从油樟叶中分离出对拟轮枝镰孢菌抑菌率达到80%的内生细菌贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis），甘蔗健康植株中是否同样含有抑制甘蔗梢腐病病原菌的内生细菌有待进一步研究。

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