一例蛋鸡J 亚群禽白血病的诊断

周戈 ，储涛

（1.岚皋县农业农村局畜牧兽医中心 陕西安康 725400；2.岚皋县佐龙镇农业综合服务站 陕西安康 725400）

禽白血病病毒（Avian Leukosis Viruses，ALV）是一类主要引起禽类各种造血细胞肿瘤性增生为特征的反转录病毒群[1]。该病病毒群根据病毒囊膜糖蛋白的抗原差异性、病毒干扰实验、宿主范围和基因组的分子生物学等特征，总共分为10 个亚群，被命名为A 亚群至J 亚群。其中A、B、C、D 亚群为外源性病毒，能够诱发肿瘤性新生物；E、F、G、H、I 亚群为内源性病毒，没有致瘤性；J 亚群禽白血病病毒（Subgroup J Avian Leukosis Virus，ALV-J）具有其他亚群的所有特性，同时也表现出自身独特性，其传播性和致病性均比其它亚群强。近几年国内出现的禽白血病感染病例主要以J 亚群病毒感染为主[2]。

禽白血病的传播方式有两种，即水平传播、垂直传播[3]。水平传播的途径是直接接触。除了直接接触传染外；间接方式也可以导致传染。垂直传播的途径是从带有禽白血病的种鸡场引种，从而孵化出的鸡苗带毒。发病蛋鸡主要表现为食欲不振、贫血、极度消瘦、产蛋率下降等症状；剖检后可发现极度消瘦，龙骨发育不全，全身性贫血，增生型的特征性肉眼病变是肝、脾、肾呈弥漫性肿大；而且鸡胚也发生病变。该病可以抑制机体免疫系统的表达，能引起鸡多种具有传染性的良性和恶性肿瘤，其高死亡率和淘汰率给养鸡业造成了巨大的经济损失。

禽白血病流行主要原因是种鸡群净化不彻底，无法控制传染源，导致大量流行。笔者在安康岚皋农业大学动科院实验室实习期间，参与接诊了一起安康岚皋某鸡场蛋鸡死亡的病例，经过一系列的检测，最终确诊为ALV-J 感染。现将基本情况报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1）发病情况。2021 年9 月，安康岚皋某鸡场12 月龄蛋鸡出现食欲不振、精神沉郁、贫血、极度消瘦、产蛋率下降等症状，鸡场饲养土鸡数量约为4 000 羽。该鸡群于2021 年9 月12 日开始陆续出现死亡，到9 月16 日为止共计发病400 羽，发病率为4.4%，死亡40 羽，死亡率10%。该鸡场蛋鸡的饲养方式是散养，免疫程序为常规免疫，采用的饲料为全价饲料。观察畜主带过来的饲料样品，未发现有霉变的情况，求诊之前没有使用过药物，由此排除了中毒等原因造成蛋鸡出现此症状的可能性，初步怀疑蛋鸡出现此症状是传染病造成的。再结合临床症状和病理剖检结果，筛选出细菌、禽流感（AIV）、新城疫（NDV）和禽白血病四个可疑病因。

2）临床症状。观察病鸡，可见缩颈，鸡冠苍白皱缩，食欲不振，精神沉郁，极度消瘦，排灰色稀状粪便。病情严重的蛋鸡甚至不能站立。

3）仪器与试剂。普通琼脂培养基、50×TAE 缓冲液、双蒸水、PBS溶液和75%乙醇为本实验室制备保存；革兰氏染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；2×Buffer PCR Master Mix 购于天根生化科技（北京）有限公司；EB（Ethidium bromide，EtBr）、琼脂糖、氯仿和异丙醇为国产分析纯产品。生化培养箱：LRH-25oA 型广东医疗器械厂；超净工作台：SPEGAIRTECH；PCR 仪：Hybaio 公司；冷冻高速离心机：18PR-52 型日本；冷冻台式离心机：Heitthc 公司产品；紫外分光仪：PE 公司；电泳设备：BIORAD 公司。

1.2 方法

1）细菌的分离与鉴定。细菌分离培养：用接种环取心包积液、肝脏切面接种于普通琼脂板上，37 ℃恒温箱中培养12 h。观察菌落形态。

2）AIV 和NDV 的PCR 检测。利用实验室已确定的禽流感和新城疫病毒RT-PCR 检测方法对采集的病料进行检测。

病料研磨：无菌条件下采集病鸡胰脏、脾脏、肝脏等病料，2～8 ℃保存。取组织混样约0.5 g，加1 mL 生理盐水研磨到没有块状的混杂液，然后将样品转到1.5 mL 灭菌离心管中，8 000 rpm 离心2 min，取100 μL 的上清液至1.5 mL 灭菌离心管当中。

总RNA 提取：利用Trizol 法提取细胞总RNA。

①病料组织中加2～3 mLPBS 研磨，冻融三次8 000 r/min 离心3 min；②取上清液200 μL 样品+1 mL Trizol 酶4 ℃裂解10～20 min；③加200 μL 氯仿，充分振荡，12 000 r/min 离心10 min；④取上清液400 μL ，加等量的异丙醇，手动上下颠倒混匀，4 ℃静置10～20 min；⑤12 000 r/min 离心10 min，弃上清液，加入750 μL 75%乙醇，手动上下颠倒混匀；⑥12 000 r/min 离心10 min；⑦弃上清液，倒置在滤纸上，吹干5 min，加10 μL ddH2O。

反转录：用上述提取的总RNA 为模板，用OligaodT 引物进行反转录。具体步骤按照TaKaRa 公司反转录体系（见表1）说明书按如下进行。

表1 反转录体系

AIV 和NDV 引物的设计与合成：根据AIV 和NDV 的保守片段，同时采用Primer Express 5.0 软件，设计了扩增片段为453 bp 的AIV 的一对引物，扩增片段为421 bp 的NDV 的一对引物，由TaKaRa 公司合成，引物序列如下：

AIV：P1:5’-ATGAGTCTTCTTCCGAGGTCA-3’；P2:5’-ACTCCA GCTCGTGTTGACAAT-3’

NDV：P1:5’-TTATAGTTAGTTTACCTGTCT-3’；P2:5’-GTAGTT TTTTCTTAAATCTTC -3’

AIV 和NDV 的PCR 扩增（见表2）：

表2 AIV和NDV的PCR体系

AIV 的PCR 反应体系：反应程序为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；54 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共35 个循环；最后72 ℃延伸10 min；PCR 产物4 ℃保存。

NDV 的PCR 反应体系：反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸2 min，共30 个循环；最后72 ℃延伸10 min；PCR 产物4 ℃保存。

PCR 扩增产物分析：称取0.3 g 琼脂糖加入30 mL TAE 缓冲液，摇匀，微波炉加热至琼脂糖完全溶解，将制胶板放入制胶槽中，插入合适的梳子，将溶解的琼脂糖TAE 缓冲液加入2 μL EB 后，混合均匀，倒入其中，直至厚度达4～6 mm，在室温下冷却凝固。将AIV的PCR 和NDV 的PCR 反应产物以及DL 600 Marker 在100 V 电压下电泳30 min 后在凝胶成像系统下观察电泳结果并进行分析。

3）ALV-J 的PCR 检测。从病鸡中提取病料后进行PCR 检测。根据ALV-J 原始毒株HPRS-103 的基因组DNA-gp85 基因中的一段序列设计引物。引物序列如下：

P1:5’-CCCAAGCTTGGAGTTCATCTGTTGCGA-3’

P2:5’-CGCGGATCCGCGCCTGCTACGGCGGT-3’

ALV-J 的PCR 扩增（见表3）：

表3 ALV-J的PCR反应体系

ALV-J 的PCR 反应体系：反应程序为95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共35 个循环；最后72 ℃延伸10 min。

PCR 扩增产物分析：称取0.3 g 琼脂糖加入30 mL TAE 缓冲液，摇匀，微波炉加热至琼脂糖完全溶解，将制胶板放入制胶槽中，插入合适的梳子，将溶解的琼脂糖TAE 缓冲液加入2 μL EB 后，混合均匀，倒入其中，直至厚度达4～6 mm，在室温下冷却凝固。将ALV-J 的PCR 反应产物以及DL 2000 Marker 在100 V 电压下电泳30 min 后在凝胶成像系统下观察电泳结果并进行分析。预期扩增目的片段为968 bp。

2 结果

2.1 病理变化

对病死鸡进行解剖，可见极度消瘦，龙骨发育不全，全身性贫血，主要病变情况有肝脏肿胀、脾脏肿胀、心冠状脂肪消失、心脏肿瘤、肌肉肿瘤、肾脏肿瘤、肌胃肿瘤。

观察畜主带来的饲料样品，没有发现其他可导致鸡出现此类情况的物质，并且在此之前并没有进行药物治疗，所以初步怀疑是传染病。

2.2 病因初步分析

根据临床检查与询问得知，饲养规模约为9 000 羽，共计发病400 羽，发病率4.4%，死亡40 羽，死亡率10%。观察畜主带过来的饲料样品，没发现有霉变的情况，求诊之前没有使用过药物，由此排除了中毒等原因造成蛋鸡出现此症状的可能性，初步怀疑蛋鸡出现此症状是传染病造成的。再结合临床症状和病理剖检结果，筛选出细菌、禽流感、新城疫和禽白血病四个可疑病因。

2.3 细菌分离鉴定结果

培养24 h 后，发现普通琼脂板上并无菌落，所以排除细菌的感染。

2.4 AIV 和NDV 的PCR 检测结果

应用RT-PCR 方法进行禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒（NDV）检测，结果在条带大小为460 bp 附近没有扩增出片段（见图1）。所以排除AIV 和NDV 的感染。

图1 禽流感病毒新城疫病毒PCR 产物电泳图

2.5 ALV-J PCR 的检测结果

应用PCR 方法进行禽白血病病毒的检测，结果扩增出目的片段968 bp（见图2）。可以进一步怀疑该病毒为ALV-J。

图2 禽白血病病毒PCR 产物电泳图

2.6 序列分析

将禽白血病病毒PCR 产物送上海生物公司测序：将测得的序列与NCBI 网站上基因序列进行同源性比对（见表4）。

表4 J亚群禽白血病病毒DNA序列比对结果

由表4 可知，该检测病样DNA 序列与多株J 亚群禽白血病病毒DNA 序列同源性达99%，确定该病为禽白血病。

2.7 病因确定和处置

综上所述，可以确定该鸡场蛋鸡是由ALV-J 感染所引起的，无细菌和AIV 以及NDV 感染。建议从以下几个方面来预防：①保证充足的饲养密度；②提供合理的营养，保证鸡群的正常生长和免疫系统的充分发育；③淘汰病鸡，防止正常鸡受到感染；④防止鸡群的垂直传播和水平传播，种蛋孵化应选择健康、不带毒的孵化鸡苗；及时清理病鸡和可疑鸡的排泄物和分泌物。

3 讨论

从临床上观察病鸡，可见缩颈，鸡冠苍白皱缩，食欲不振，精神沉郁，极度消瘦，排灰色稀状粪便。病情严重的蛋鸡甚至不能站立。对病死鸡进行解剖，可见极度消瘦，龙骨发育不全，全身性贫血，主要病变情况有肝脏肿胀，脾脏肿胀，心冠状脂肪消失，心脏肿瘤，肌肉肿瘤，肾脏肿瘤，肌胃肿瘤。由此我们可以初步推断出是ALV-J感染，或者与其他病菌混合感染，所以我们要进行多方面的检测来确定确切病因。首先我们进行了细菌的分离与鉴定[4]，发现并无细菌感染，其次我们对病料进行了AIV 和NDV 的PCR 检测，病毒经引物进行特异性PCR 扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据凝胶电泳图可以看出AIV 和NDV 为阴性，由此我们可以判断此病例没有AIV 和NDV 的混合感染。

最后对ALV-J 进行了PCR 检测，在PCR 检测中，利用Marker（2 000 bp）阳性对照与阴性对照作为对照，从结果来看，被检病样DNA 大小均为968 bp 左右，将PCR 产物和rDNA 引物送至上海生物公司进行测序后与NCBI 进行对比分析发现，该病样与ALV-J有99%的同源性，确定该病为J 亚群禽白血病。

3.1 禽白血病易发原因

禽白血病易发离不开它的垂直传播；鸡场如若从带有禽白血病的种鸡场接种，从而孵化出带毒的鸡苗，使得禽白血病在鸡群中世代存在提供了途径。

其次，禽白血病的水平传播是该病易发的主要传播方式[5]；鸡群在狭小的饲养空间里，正常鸡很容易直接接触病鸡，且病鸡的排泄物和分泌物也很容易被病鸡所接触，这给禽白血病的水平传播提供了便捷的途径。

再而，我国某些地方种鸡本身就带有禽白血病，畜主如若没有及时发现并淘汰，此种鸡便会成为传染源，让禽白血病肆意传播。另一方面，如若疫苗受到禽白血病感染，然后将受污染的疫苗接种于鸡群上，整个鸡群将感染禽白血病，后果不堪设想。

禽白血病易发主要的原因还是种鸡群净化不彻底，无法控制传染源，导致大量流行；如果不从源头来预防禽白血病，禽白血病将屡禁不止。

3.2 禽白血病的预防

预防禽白血病主要还是种鸡群净化，畜主应当做好以下几个方面：

①防止垂直传播。畜主应当从没感染禽白血病的种鸡场接种，从而孵化出不带毒、健康的鸡苗；这样可以从种源处杜绝污染，给鸡群提供了可持续发展的道路；②防止水平传播。畜主应当时刻关注鸡群，发现病鸡或可以排下的粪便或分泌物应及时采取堆沤、生物发酵、消毒等手段，来杀死病毒[6]；③防止疫苗污染。在制造疫苗过程中，应防止疫苗被禽白血病毒（ALV）感染，否则接种疫苗后将引起大规模的蛋鸡发病，后果不堪设想，因此，鸡场应选用品质有保证的疫苗；④净化环境与消毒。对鸡舍定期进行高温消毒，用酸性消毒剂喷洒消毒，可大量杀死病原，减少禽白血病发病率；⑤加强饲养管理。对产蛋前后的易感群采取主动保护措施，关注外界环境对鸡群的影响。饲喂品质可靠的饲料，及时清理发霉、变质的饲料，保证鸡群的正常生长和免疫系统的充分发育，合理添加维生素和微量元素来增强鸡群的免疫力[7]；⑥保证充足的饲养密度。合理区分鸡群，保证鸡群不同大小个体不同栏舍等。保证充足的饲养密度，防止鸡群挤在一起生活，随着蛋鸡的生长发育，畜主应当适当调整鸡舍的大小来减少禽白血病的发病率。

4 结论

1）从安康岚皋某鸡场的病鸡中提取出病料，进行细菌的分离与鉴定和AIV 和NDV 的PCR 检测，结果发现并无禽流感病毒和新城疫病毒的感染，且无细菌感染。

2）从接种病料中设计出一对针对ALV-J 的特异性引物，进行扩增，获得一个长度为968bP 的片段，与预期片段大小相符。

3）经序列分析，该检测病样DNA 序列与J 亚群禽白血病病毒DNA 序列同源性达99%，表明该病为禽白血病。■