不同再灌注时间对缺血后大鼠肝组织氧化应激水平的影响

陈名阳 胡亚荣 田新雁 陆丽 苏娟 顾伟

肝缺血再灌注损伤（Hepatic ischemia-reperfusion injury，HIRI）是指肝脏组织缺血一段时间后再恢复血液灌注，不但没有使肝脏功能、结构恢复，反而加重其损伤程度的现象。HIRI 是肝移植、肝切除等外科操作中必经的过程，这一过程不仅使肝细胞代谢、结构紊乱和功能缺失，还影响肝功能恢复与预后，成为临床肝脏疾病发展的重要因素[1～3]。

HIRI 发生机制十分复杂，氧化应激是导致肝脏损伤的主要因素。机体存在着抗氧化系统，可减少氧化应激反应带来的损害。当氧化应激反应加重时，抗氧化反应也会有所增加，参与氧化应激与抗氧化的化合物水平会发生改变，检测其含量的变化能从侧面反映机体氧化与抗氧化的程度[4～6]。本研究通过构建HIRI 模型，着重研究不同时长再灌注对机体氧化与抗氧化平衡的影响，为临床防治HIRI 提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级SD 雄性大鼠42 只，8 周龄，体重180～220g，购自昆明医科大学实验动物中心[SYXK（滇）K2015-0002]。适应性饲养1 周后，建立大鼠HIRI 模型。

1.2 大鼠HIRI 模型制备实验大鼠术前24h 禁食不禁水，使用1%戊巴比妥钠（6mL/kg，ip）麻醉实验大鼠，下腹部正中切口，暴露肝脏，轻轻拉出肝左叶和肝中叶，采用无损伤血管夹夹闭肝左叶和肝中叶的门静脉和肝动脉，建立肝脏缺血模型，用生理盐水浸润暴露的肝脏，在肝脏缺血90min 后撤掉血管夹建立再灌注模型，待肝脏颜色恢复后，缝合实验大鼠腹腔，手术过程始终在鼠台上进行，并保持大鼠体温在（37±0.5）℃。

1.3 实验动物分组将42 只SD 大鼠随机分为假手术对照组（Sham 组）、缺血组（HI 组）和缺血再灌注组（HIR 组）。其中HIR 组设置5 个再灌注时间段，分别为再灌注3h（HIR3h 组）、再灌注6h（HIR6h组）、再灌注12h（HIR12h 组）、再灌注24h（HIR24h组）和再灌注72h（HIR72h 组），每组6 只大鼠。其中Sham 组不阻断血流，仅进行肝蒂部干扰，90min后直接取材。HI 组阻断血流90min 后直接取材。HIR 组在进行血流阻断90min 后进行再灌注，分别在肝脏再灌注3、6、12、24、72h 后进行取材。

1.4 实验试剂天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒、丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒、黄嘌呤氧化酶（XOD）试剂盒、一氧化氮合酶（NOS）试剂盒、一氧化氮（NO）测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，透明质酸（HA）试剂盒、层黏连蛋白（LN）测定试剂盒均购自上海泛柯实业有限公司。

1.5 标本处理和指标测定麻醉实验大鼠后，用5mL 无菌注射器于下腔静脉取血（3%肝素钠抗凝），低温静置30min 后，4 ℃，3 000r/min 离心10min，分离获得血浆，测量血浆中各指标含量。采血结束后，遵循动物伦理原则处死大鼠，取其肝脏，低温生理盐水冲洗干净后，分离肝脏左外侧叶，制作组织病理切片和10%肝匀浆液，按照试剂盒说明书进行相关生化指标检测。

1.6 肝组织形态学观察取肝左外侧叶部分组织，4%多聚甲醛溶液中固定24h 后进行石蜡包埋，再用切片机制作成4μm 切片，脱水透明后进行HE染色，光学显微镜下观察肝组织病理损伤变化。

1.7 统计学方法应用SPSS 23.0 统计软件分析实验数据，计量资料以均数±标准差（）表示，组间差异比较采用单因素方差分析（One -Way ANOVA），两组间比较采用LSD-t检验分析，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肝组织形态学变化光学显微镜下Sham 组可见到假小叶结构完整，肝组织汇管区及中央静脉完整，肝细胞排列整齐，形态正常，大小均匀，无坏死以及变性；HI 组肝细胞索状排列整齐，分布不均匀，有少量变性和坏死，有红细胞聚集和较少炎性细胞浸润；HIR3h 组和HIR6h 组肝细胞排列不齐且不均匀，少量细胞出现坏死与变性，肝窦挤压变形且有大量红细胞淤积，少量炎性细胞浸润；HIR12h 组和HIR24h 组肝细胞排列不整齐且细胞基本形态消失，大小不一，有不同程度变性、水肿与坏死，肝窦挤压变形甚至消失，有大量炎性细胞浸润；HIR72h 组炎性细胞变少，肝细胞较24h 完整且排列整齐，坏死及变性明显减少，红细胞淤积减少，肝组织形态逐渐恢复。HIR 组的肝组织损伤以HIR24h 组最为严重，肝细胞出现水肿和局灶坏死，且有大量炎性细胞浸润。见图1。

2.2 各组大鼠血浆中ALT、AST 水平变化与Sham组相比，HI 组、HIR3h 组、HIR6h 组、HIR12h 组、HIR24 组大鼠血浆ALT、AST 水平升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）；与HI 组相比，HIR3h 组、HIR6h 组、HIR12h 组大鼠血浆ALT、AST 水平均升高，HIR72h 组ALT、AST 水平均降低，差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

图1 各组实验大鼠肝组织形态学变化

表1 各组大鼠血浆中ALT 和AST 活力的变化（）

表1 各组大鼠血浆中ALT 和AST 活力的变化（）

注：与Sham 组比较，*P<0.05；与HI 组比较，#P<0.05

2.3 各组大鼠肝组织中MDA 和SOD 水平变化与Sham 组相比，HI 组、HIR24h 组、HIR72 组MDA水平升高，差异具有统计学意义（P<0.05），HI 组、HIR3h 组、HIR6h 组、HIR12h 组、HIR24h 组SOD水平降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；与HI组相比，HIR3h 组、HIR6h 组MDA 水平降低，HIR72h 组MDA 水平升高，差异均具有统计学意义（P<0.05），HIR3h 组、HIR6h 组、HIR12h 组、HIR72h组SOD 水平升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肝组织中MDA 和SOD 水平变化（）

表2 各组大鼠肝组织中MDA 和SOD 水平变化（）

注：与Sham 组比较，*P<0.05；与HI 组比较，#P<0.05

2.4 各组大鼠肝组织中GSH 和GSH-Px 水平变化与Sham 组相比，HIR6h 组、HIR12h 组GSH 水平降低，HI 组、HIR3h 组、HIR6h 组、HIR12h 组、HIR24h 组、HIR72h 组GSH-Px 水平降低，差异均具有统计学意义（P<0.05）；与HI 组相比，HIR6h 组、HIR12h 组GSH 水平降低，HIR6h 组、HIR12h 组GSH-Px 水平降低，HIR24h 组、HIR72h 组GSH-Px水平升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 各组大鼠肝组织中GSH 和GSH-Px 水平变化（）

表3 各组大鼠肝组织中GSH 和GSH-Px 水平变化（）

注：与Sham 组比较，*P<0.05；与HI 组比较，#P<0.05

2.5 各组大鼠肝组织中CAT 和XOD 水平变化与Sham 组相比，HIR3h 组、HIR6h 组、HIR12h 组、HIR24h 组CAT 水平降低，HIR6h 组、HIR12h 组、HIR24h 组XOD 水平升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）；与HI 组相比，HIR3h 组、HIR6h 组CAT 水平降低，HIR6h 组、HIR12h 组、HIR24h 组、HIR72h 组XOD 水平升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表4。

表4 各组大鼠肝组织中CAT 和XOD 水平变化（）

注：与Sham 组比较，*P<0.05；与HI 组比较，#P<0.05

2.6 各组大鼠肝组织中NOS 和NO 水平变化与Sham 组相比，HI 组、HIR3h 组、HIR6h 组、HIR12h组、HIR72h 组NOS 水平降低，HIR3h 组、HIR6h 组、HIR12h 组、HIR24h 组、HIR72h 组NO 水平升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）；与HI 组相比，HIR6h 组、HIR12h 组、HIR24h 组、HIR72h 组NO水平升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表5。

表5 各组大鼠肝组织中NOS 和NO 水平变化（）

表5 各组大鼠肝组织中NOS 和NO 水平变化（）

注：与Sham 组比较，*P<0.05；与HI 组比较，#P<0.05

2.7 各组大鼠肝组织中LN 与HA 水平变化与Sham 组相比，HIR3h 组、HIR12h 组、HIR24h 组、HIR72h 组LN 水平升高，HI 组、HIR3h 组、HIR6h组、HIR12h 组、HIR24h 组、HIR72h 组HA 水平升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）；与HI 组相比，HIR12h 组、HIR24h 组、HIR72h 组LN 水平升高，HIR6h 组、HIR12h 组、HIR24h 组、HIR72h 组HA 水平升高，差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表6。

表6 各种大鼠肝组织中HA 和LN 水平变化（）

表6 各种大鼠肝组织中HA 和LN 水平变化（）

注：与Sham 组比较，*P<0.05；与HI 组比较，#P<0.05

3 讨论

缺血再灌注损伤包括了缺血损伤和再灌注损伤两个时期。在缺血损伤期，因氧供减少和耗竭，三磷酸腺苷（ATP）的生成锐减，钠泵功能障碍，Na+潴留于细胞内而使细胞内渗透压升高，促使水大量进入细胞而发生细胞水肿变性，严重时可发生细胞坏死[7～9]。缺血也可导致线粒体功能障碍，呼吸链传递电子错误，产生少量氧自由基，而出现轻度氧化损伤[10～12]。所以在本研究中可见肝组织在缺血期时出现了少量的细胞变性和坏死，以及SOD 和GSH-Px 活力的降低和MDA 水平的升高。

在再灌注损伤期，氧供虽然增加，但由于线粒体功能障碍、中性粒细胞激活、黄嘌呤氧化酶增多及儿茶酚胺自氧化等作用，可促使细胞产生过多的氧自由基、过氧化氢等活性氧（ROS）[13～15]。ROS 作用于细胞膜内不饱和脂肪酸，启动膜脂质过氧化链式反应，可破坏细胞的完整性；同时ROS 可使胞质中的某些酶和膜蛋白交联生成二聚体或更大的聚合物，从而使其失去活性，导致细胞功能异常；ROS还可穿透核膜进入细胞核内，使碱基羟化、DNA 断裂、染色体畸变，诱导细胞凋亡和死亡。过多ROS也可激活中性粒细胞，使其释放大量的炎性因子而引发炎症反应，进而加重组织细胞的损伤[16～18]。

缺血再灌注损伤的防治，首要是尽量缩短缺血时间。但是在临床上因肝移植或肝脏切除术的复杂性，手术时间不可能较短，故HIRI 的治疗重点是恢复血液灌流后减轻或消除再灌注损伤。氧自由基、ROS 产生过多是缺血再灌注损伤发生的重要机制[19，20]。而关于活性氧在再灌注后什么时候开始产生并引发细胞和组织严重损伤，临床和实验室的研究报道不一，缺乏系统性的研究。故本研究通过复制大鼠HIRI 模型，通过病理形态学观察及检测ALT、AST、氧化产物（MDA）含量、抗氧化酶（SOD、GSH-Px、CAT）活力、NO 合酶系统及XOD 等含量来了解不同再灌注时间对缺血后肝组织的影响。本研究显示，肝缺血后恢复血液再灌注，随着再灌注时间延长肝细胞损伤逐渐加深，在24h 时出现了明显的水肿、变性和坏死。ALT、AST 的含量也随再灌注时间有所增加并于12h 达到顶峰。SOD、CAT、GSH-Px 等抗氧化酶从再灌注3h 起逐渐降低，在12～24h 期间变化最明显（P<0.01）。NO 和XOD 的含量从再灌注6h 起开始升高，也是在12～24h 期间变化最明显（P<0.01）。NOS 在肝脏缺血和恢复血流再灌注后均出现了降低（P<0.05）。MDA、LN、HA的含量随再灌注时间逐渐升高，在72h 时达高峰（P<0.01）。

HIRI 是一个复杂的病理过程，本研究观察了不同再灌注时间对缺血后大鼠肝组织氧化应激水平的影响，研究提示再灌注损伤在12～24h 期间变化最明显，随后肝组织损伤有所修复，但是肝纤维化程度却有所增高，而HIRI 致肝纤维化的机制有待进一步深入研究。