生长发育初期四角蛤蜊对空气暴露的响应

马贵范，郭文学，杨凤，闫喜武

（1.威海海洋职业学院，山东 荣成 264300；2.荣成市渔业技术推广站，山东 荣成 264300；3.大连海洋大学辽宁省贝类良种繁育工程技术研究中心，农业农村部北方海水增养殖重点实验室，辽宁 大连 116023）

贝类离水后，能在一段相当长的时间内维持生命力，这种离水后能维持生命活动的时间，称为贝类“露空时间”[17]。随着养殖业的发展，开发鱼类、海参、虾蟹等经济动物与四角蛤蜊等滩涂贝类混养模式，是充分利用养殖水体，拓展养殖空间，优化养殖生态系统结构和功能，提高对营养物质的吸收和利用，降低养殖污染物排放，实现生态养殖的重要途径与发展方向[18,19]。生产中，贝类苗种的转运是在离水状态下进行，若“露空时间”过长，贝类会因不能从周围环境中获得足够的氧和排出二氧化碳而死亡。研究结果表明，不同发育时期的滩涂贝类稚贝转移至野外进行中间培育，成活率出现从10%～70%不等[20]，这可能与稚贝的发育时期和露空时间有关。本实验研究了不同发育时期的四角蛤蜊幼虫或稚贝对空气暴露的耐受性，以及空气暴露后的生长存活，探明四角蛤蜊早期生长发育对空气暴露的响应，精准掌握四角蛤蜊不同发育时期幼虫或稚贝的空气暴露耐受性规律，更好地指导养殖。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2012 年8 月在庄河市海洋贝类育苗场进行，所需四角蛤蜊取自该场的繁殖群体。

1.2 方法

根据四角蛤蜊早期生长发育规律，研究了D 形幼虫、变态期幼虫、30 日龄稚贝和60 日龄稚贝对空气暴露的响应。根据日常观察和预实验测定结果，每个时期的幼虫或稚贝设置不同的空气暴露时间梯度，研究其对空气暴露的响应和恢复自然条件后的生长存活情况。D 形幼虫为孵化后1 d 的幼虫，壳长（99.5±5.8）μm；变态期幼虫为孵化后15 d 的幼虫，壳长（246.5±23.9）μm；30 日龄稚贝壳长为（1 065±195）μm；60 日龄稚贝根据壳长分成大规格（9.15±0.87）mm、中规格（7.01±0.71）mm 和小规格（4.41±0.66）mm。实验组每组幼虫数量约50 个，稚贝数量约30 枚，每组设置3 个重复。空气暴露结束后幼虫连续培养7 d、稚贝连续培养15 d 后观察其生长情况。

1.2.1 D 形幼虫在不同空气暴露时间下存活率与生长的比较

试验在室温28.8 ℃，湿度为50%～60%下进行。用300 目的筛绢过滤一定数量的D 形幼虫，平均分摊在7 块300 目的筛绢（10 cm×10 cm）上，再用干纱布从筛绢网底部吸干水分后，悬空在烧杯（500 mL）中进行空气暴露试验（图1）。

图1 幼虫空气暴露装置图Fig.1 The device diagram of air exposure test for larvae

空气暴露时间设置7 个梯度：0 min、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min。在各个时间组的空气暴露胁迫完成后，依次将每块筛绢上的D形幼虫平均分成三份，每份幼虫数量约50 个，放入28 ℃砂滤海水中培养7 d，期间连续微量充气，每日饱食投喂鲜活等边金藻（Isochrysis galbana）2 次，换水1 次。观察并记录培养1 d、4 d 和7 d 时各组幼虫的死亡情况；4 d 和7 d 时测量各存活组贝壳长，按下式计算各组的存活率与生长速度。死亡的判断标准为幼虫不能上浮和活动。幼虫存活率和相对日生长（G）按下式计算：

幼虫存活率=存活的幼虫密度/实验开始的幼虫密度×100%；

结合电力电缆故障诊断的具体情况，需要对各种问题进行分析，电网本身不稳定，为了保证供电的正常，需要做好故障诊断工作，尽快处理。电力电缆故障的诊断技术如下：

其中，L0：上一次测定的壳长（mm）；L1：本次测定的壳长（mm）；t0：上一次测定的日龄（d）；t1：本次测定的日龄（d）；G：相对日生长。

1.2.2 变态期幼虫在不同空气暴露时间下的存活率与生长的比较

变态期幼虫空气暴露时间梯度设置为0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h 和3 h，空气暴露时平均室温为29 ℃，湿度为50%～60%，空气暴露胁迫后海水培养的温度为28 ℃。其他同试验1.2.1。

1.2.3 30 日龄稚贝在不同空气暴露时间下的存活率与生长的比较

试验时平均室温为29.6 ℃，湿度为50%～60%，时间梯度设置为0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h 和10 h。具体操作为：随机挑选约1 000 枚稚贝，平均分成9 份，依据设置好的空气暴露时间进行试验，每个时间梯度设置3 个平行。空气暴露胁迫完成后放入正常海水常规培养15 d，每3 d 测量一次各组的壳长，其他同试验1.2.1。以光学显微镜下观察稚贝的贝壳张开或不能正常闭合为稚贝的死亡标准。

1.2.4 不同规格的60 日龄稚贝在不同空气暴露时间下的存活率的比较

将60 日龄的稚贝依据壳长划分为大（9.15±0.87）mm、中（7.01±0.71）mm、小（4.41±0.66）mm三种规格。每种规格每个时间梯度的稚贝数量为30枚，每组设置3 个平行。时间梯度设置为0 h、6 h、12 h、18 h、24 h 和30 h。其他同试验1.2.1。

1.3 数据处理

采用SPSS 统计软件单因素方差分析（one-way ANOVA）对数据进行分析处理,用LSD 法进行组间多重比较，显著性差异水平设为P<0.05，Excel 作图。采用半致死时间（LT50）来比较对空气暴露的耐受能力。用100%存活的最长胁迫时间到0 存活的最短胁迫时间内的存活率（y）与胁迫时间（x）进行回归分析，建立回归方程，根据回归方程求半数致死时间（LT50）。

2 结果与分析

2.1 D 形幼虫不同空气暴露时间下的存活率和生长比较

四角蛤蜊D 形幼虫空气暴露胁迫后的存活率结果如图2 所示。空气暴露组的幼虫恢复到自然海水培养1 d 的存活率没有明显降低（P>0.05）。当连续培养到4 d 甚至更长（7 d）时，随着空气暴露时间的延长，幼虫存活率显著下降（P<0.05）。空气暴露时间范围在80 min 内，各处理组的存活率（4 d 和7 d）与对照组无显著差异（P>0.05）；空气暴露时间超过100 min，存活率显著低于对照组（P<0.05）。

图2 D 形幼虫不同空气暴露时间下的存活率Fig.2 The survival rate of D-shaped larvae in different air exposure periods

图3 变态期幼虫在不同空气暴露时间下的存活率Fig.3 The survival rate of metamorphosis-stage larvae in different air exposure periods

经过短时间（20 min）空气暴露的D 形幼虫恢复到正常海水培养0～4 d 与对照组相比表现出了一定的生长优势，但优势不明显：4 d 两者壳长有显著差异（P<0.05），0～4 d 相对日生长无显著差异（P>0.05，表1）；但连续培养7 d，对照组的相对日生长显著高于其他空气暴露组（P<0.05）。在整个培养期间，20 min 空气暴露组的D 形幼虫生长速度快于其他处理组，但差异不显著（P>0.05）；空气暴露100 min 后D形幼虫的相对日生长最小，说明长时间的空气暴露不仅对D 形幼虫的存活有显著影响（P<0.05），也会降低D 形幼虫的生长速度。

表1 D 形幼虫不同空气暴露时间后的壳长和相对日生长Tab.1 The shell length and relative growth of D-shaped larvae in different air exposure periods

2.2 变态期幼虫在不同空气暴露时间下的存活率和生长的比较

空气暴露后，变态期幼虫的存活率，随培养时间的延长先降低（1～4 d）后保持平衡（4～7 d）。在相同的培养时间范围内，随着空气暴露时间的延长，幼虫的存活率显著降低（P<0.01）。培养1 d 时，0.5 h处理组的存活率为100%，1 h 和1.5 h 次之，均与对照组无显著差异（P>0.05），空气暴露2 h 幼虫的存活率显著降低（P<0.05），超过3 h 幼虫全部死亡。当

注:同列中具有相同字母的平均值间差异不显著（P>0.05），具有不同字母的平均值间差异显著（P>0.05），下同。

Note:the same letters in the same column are not significant differences（P>0.05）,and means with the different letters in the same column are significant differences（P<0.05）,et sequentia.培养至4 d 甚至7 d 时，对照组的存活率最高，0.5 h和1 h 次之，但二者显著低于对照组（P<0.05）（图2）。

空气暴露对变态期幼虫的生长影响结果见表2。在前期（0～4 d），空气暴露对变态期幼虫的生长表现为无序性，生长速度除空气暴露1 h 和空气暴露2.5 h 组高于对照组（P>0.05）外，其他各组均显著低于对照组（P<0.05），空气暴露1.5 h 的生长速度最慢。在后期（4～7 d），幼虫经过空气暴露后，生长速度显著高于对照组（P<0.05）；其他处理组之间部分存在显著性差异（P<0.05），如空气暴露1.5 h 和空气暴露2 h 组的相对日生长最大，分别显著高于空气暴露1 h 组和2.5 h 组（P<0.05），其中空气暴露1 h 组的相对日生长最低。

表2 变态期幼虫不同空气暴露时间后的壳长和相对日生长Tab.2 The shell length and relative daily growth of metamorphosis-stage larvae in different air exposure periods

2.3 30 日龄稚贝在不同空气暴露时间下的存活率和生长的比较

30 日龄稚贝（壳长1.13～1.25 mm）经过空气暴露胁迫后，正常海水培养1 d 的存活率与培养15 d的存活率无差异（图4）。空气暴露2 h 内，稚贝存活率为100%；稚贝100%死亡的最短空气暴露时间为6 h；在2～6 h 内，随着空气暴露时间的延长，存活率显著降低（P<0.05），空气暴露时间为4 h，存活率约为50%。

图4 30 日龄稚贝在不同空气暴露时间下的存活率Fig.4 The survival rate of 30-day-old juveniles in different air exposure periods

30 日龄稚贝经过空气暴露后的生长情况见表3 和表4。海水培养3 d 时，空气暴露组稚贝的生长和对照组无显著差异（P<0.05）；继续培养至6 d 时，除空气暴露4 h 组的相对日生长显著高于对照组外（P<0.05），其他各处理组稚贝的的相对日生长与对照组无显著性差异（P>0.05）；在培养的后期（6～15 d），各处理组的生长和对照组无显著差异（P>0.05）；各处理组之间的平均日生长也无显著差异（P>0.05）。从整个培养阶段看，空气暴露对1 mm 左右的稚贝生长无显著性影响。

表3 30 日龄稚贝在不同空气暴露时间下的壳长Tab.3 The shell length of 30-day-old juveniles in different air exposure periods

表4 30 日龄稚贝不同空气暴露时间下的相对日生长Tab.4 The relative daily growth of 30-day-old juveniles in different air exposure periods

2.4 60 日龄不同规格的稚贝在不同空气暴露时间的存活率比较

从图5 看出，60 日龄大规格稚贝100%存活的空气暴露时间为18 h；中规格稚贝100%存活的空气暴露时间为6 h；小规格稚贝（4.41±0.66）mm 空气暴露6 h 的存活率约为93%。大规格稚贝空气暴露24 h 出现死亡，100%存活率的最长空气暴露时间在18～24 h，空气暴露24～30 h，存活率急剧下降，空气暴露30 h 无存活；中规格稚贝空气暴露12 h存活率为77.8%，100%存活的最长空气暴露时间在6～12 h，空气暴露时间超过30 h，稚贝全部死亡；小规格稚贝空气暴露6 h 开始出现死亡，空气暴露24 h 无存活。

图5 60 日龄稚贝在不同空气暴露时间下的存活率Fig.5 The survival rate of 60-day-old juveniles in different air exposure periods

取大、中、小三种规格稚贝的100%存活的最长空气暴露时间和0 存活的最短空气暴露时间内的数据进行回归分析，发现存活率（y，%）与空气暴露时间（x，h）直线相关显著（P<0.05）。直线方程依次为y=-8.3333x+255.56（R2=0.9643），y=-4.537x+129.44（R2=0.9558）和y=-5.7778x+130（R2=0.9074）。根据直线方程分别求出大，中和小规格稚贝的半致死时间分别为24.7 h、17.5 h 和13.8 h。60 日龄稚贝的耐空气暴露能力为大规格>中规格>小规格。

3 讨论

3.1 四角蛤蜊在不同发育时期的耐空气暴露能力比较

空气暴露对贝类存活率影响的研究已见于巨牡蛎（Crassostrea gigas）[21，26]、毛蚶（Scapharca subcrenate）[22]、长竹蛏（Solen stritus）[23]、海湾扇贝（Argopecten irradians）[24]、硬壳蛤（Mercenaria mercenaria）[25]、橄榄蚶（Estellarca olivacea）[27]、扇墨西哥湾贝（Argopecten irradians concentricus）[28]、彩虹明樱蛤（Moerella iridescen）[29]、菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）[30]、文蛤（Meretrix meretrix）[31]和虾夷扇贝（Patinopecten yessoensis）[32]等。贝类的耐空气暴露能力不仅与种类和空气暴露时间的长短有关，还与贝类所处的发育时期及规格密切相关[24、26、30]。本研究中，不同发育时期的四角蛤蜊幼虫或稚贝对空气暴露的耐受性不同，同一发育阶段不同规格的稚贝对空气暴露的耐受能力也有较大的差异。以LT50为依据，得出四角蛤蜊不同发育时期的耐空气暴露能力为：稚贝>变态期幼虫>D 形幼虫。与其他贝类不同发育时期的耐空气暴露能力排序有所不同。海湾扇贝耐空气暴露能力大小为：眼点幼虫＞D 形幼虫＞稚贝，太平洋牡蛎为：眼点幼虫>壳顶中期幼虫>稚贝>D 形幼虫[24、26]。这可能与不同贝类不同发育时期壳的厚薄易碎程度以及试验条件有关。四角蛤蜊D 形幼虫和变态期幼虫个体较小，壳薄易碎，离水后在较高室温下水分蒸发较快，耐空气暴露能力较低；稚贝的结构和成贝相似，软体部储存部分水分，露空后暂时利用那部分水分维持自身体内代谢，忍受空气暴露的时间较幼虫期长。在相同条件下，不同规格的四角蛤蜊稚贝的耐空气暴露能力随规格的增加而增大，这与蛤仔对空气暴露耐受性的研究结果相一致[30]。因此，在四角蛤蜊苗种繁育、滩涂放养及运输过程中，应避免长时间空气暴露，尤其是早期幼虫阶段。

3.2 空气暴露对不同发育阶段的幼虫、稚贝生长的影响

空气暴露胁迫除影响贝类的存活外，还影响生长的贝类。本研究结果发现：（1）个别空气暴露组（20 min）在前期（0～4 d）D 形幼虫具一定的生长优势，但继续培养至7 d 时，不仅生长优势消失，生长速度显著减慢；（2）培养前期（0～4 d）变态期幼虫在较对照组没有明显的生长优势，但随着培养时间的延长（4～7 d），生长速度快于对照组；（3）4 h 的空气暴露胁迫对稚贝的生长影响很小，基本上与对照组同步,表明不同发育时期的幼虫或稚贝经过空气暴露胁迫后的生长情况不同。而Hiwatari 等[10]对蛤仔的研究表明，稚贝在空气暴露胁迫完成后期（7～14 d）出现明显的生长优势。肖友翔[33]等对日本海神蛤（Panopea japonica）的研究表明，干露处理后，壳长约1.70 mm 日本海神蛤稚贝瞬时生长率显著高于对照组，存在补偿生长现象。这与四角蛤蜊稚贝空气暴露胁迫后生长情况有所差别，说明空气暴露对贝类产生的影响既与不同种类有关，也受早期生长发育阶段、培育时长及实验条件的影响。

3.3 小结

四角蛤蜊D 形幼虫空气暴露80 min 内7 d 的存活率与对照组无显著差异，但7 d 后生长显著低于对照组，建议D 形幼虫期间尽量不要离水，若离水，露空时间不要超过20 min；变态期幼虫空气暴露时间控制在1.5 h 内，存活率依然很高，后期生长速度显著高于对照组，说明四角蛤蜊幼虫变态期间适当地空气暴露，有利于刺激幼虫的变态发育，在生产中，可以通过换水等方式对变态期幼虫适当空气暴露，以提高变态率；30 日龄稚贝空气暴露2 h存活率仍可保持在100%，空气暴露后对稚贝的生长没有显著差异，也不会降低，运输30 日龄稚贝只适合短途运输（≤2 h）；60 日龄的稚贝运输时若保证100%的存活率，壳长约为9 mm 的稚贝可运输18 h，7 mm 可运输6 h，4 mm 运输时间要小于6 h。实验观察受精卵空气暴露5 min 后均不能孵化成D形幼虫，受精卵应避免出现露空时间。