酒蒸川芎贵州特色炮制方法的工艺优化*

戴 坤,杨获印,刘师愿,丁慧敏,王 勤,2▲

(1贵州中医药大学,贵州 贵阳 550025;2贵州中医药大学药物物理研究中心,贵州 贵阳 550025)

川芎为伞形科藁本属多年生草本植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥根茎[1]。最早被记载于《神农本草经》中,并被列为上品药材[2]。主产于四川、贵州、云南、广西等地区[3]。川芎中含有挥发油类、生物碱、有机酚酸类、多糖类等多种有效成分,应用广泛[4]。现代研究表明,川芎中的川芎嗪具有防止心肌缺血[5]的作用;川芎具有降压降脂、抗缺氧、镇静、镇痛、免疫、组织修复和保护性抑制等作用[6]。川芎是一味常用的活血行气药,其有效成分主要为挥发油、酚酸类的阿魏酸、川芎嗪等[7]。阿魏酸具有抗血栓、降血脂作用[8]。目前,川芎的炮制方法包括熬制、炒制、醋制、酒制、蜜制[9]等。我国各地对中药的用药习惯和炮制方法不尽相同,吴情梅等对鲜川芎饮片一体化工艺进行了优选[10],张婷婷等优选酒炙川芎的炮制工艺[11]。酒蒸川芎是具有贵州地区特色的炮制方法,但其炮制标准现今仍以经验辨识为主,且缺乏具体的炮制工艺技术参数,炮制品质量参差不齐。为了更好地控制酒蒸川芎贵州特色炮制方法的饮片质量,本研究以阿魏酸含量、醇溶性浸出物为评价性指标,采用L9(34)正交试验设计及综合分析评分法优选酒蒸川芎的最佳炮制工艺,优选酒蒸川芎炮制工艺技术参数,为建立规范的酒蒸川芎贵州炮制方法提供参考,有利于更好地指导川芎的应用。

1 材料与仪器

1.1 材料

川芎饮片购于四川省彭州,经贵州中医药大学药学院中药鉴定教研室钟可副教授鉴定为伞形科藁本属植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥根茎。阿魏酸对照品(批号:wkp21010504,四川省维克奇生物科技有限公司),黄酒(酒精度17.0%,浙江塔牌绍兴酒有限公司),甲醇、冰乙酸均为色谱纯,乙醇为分析纯,水为蒸馏水。仪器设备包括 UltiMate3000高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技),液相平头微量进样器25ul(上海安亭微量进样器厂),液相色谱柱(批号:MP2052MB03,安捷伦科技有限公司),KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司),MTQ 200电子天平(深圳市美孚电子有限公司),101-3BS电热鼓风干燥箱(上海力晨邦仪器科技有限公司),SH2-D111循环水式多用真空泵(上海予英仪器有限公司),DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 贵州特色炮制方法酒蒸川芎

取生川芎饮片,加辅料(黄酒)拌匀,置适宜容器内密封,隔水加热蒸透或用蒸汽蒸至规定程度,取出,干燥,即得[12]。

1.2.2 阿魏酸含量的测定

1)色谱条件 Agilent HC-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇-1%冰乙酸(30∶70),以甲醇为流动相A,1%冰乙酸为流动相B;紫外检测波长为321 nm;柱温30 ℃;流速为1.0 mL/min;进行等度洗脱,进样体积10 μL。

2)对照品溶液的制备 精密称取0.00505 g阿魏酸对照品,置入标准的100 mL棕色容量瓶中,加入70%甲醇溶解定容,摇匀,制成5.05 mg/mL阿魏酸溶液,作为储备液备用,即得。

3)供试品溶液的制备 取酒蒸品川芎粉末(过四号筛),精密称定0.5 g,置具塞150 mL锥形瓶中,精密加入70%甲醇50 mL,密塞,称定质量,水浴加热回流30 min,静置冷却,称定质量,用70%甲醇补足已减失的质量,摇匀,静置,取上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过,即得供试品溶液。

4)线性关系考察 用移液管精密吸取不同体积的阿魏酸对照品储备液置棕色容量瓶中,加入70%甲醇定容,配制成浓度分别为0.00505 mg/mL、0.0101 mg/mL、0.0202 mg/mL、0.0303 mg/mL、0.0404 mg/mL、0.0505 mg/mL等一系列对照品溶液。按1.2.2项下液相色谱条件,分别单独进样检测。

5)样品测定 精密称取各酒蒸品川芎粉末(过四号筛)约0.5 g,分别平行取样3份,再按照试验条件供试品溶液的配制方式,依次制备成相应试验溶液,按照1.2.2项下的色谱条件,对各试验品川芎中阿魏酸的含量进行测定,计算,即得。

1.2.3 浸出物的测定

按照《中国药典》2020年版四部醇溶性浸出物测定法(通则2201)项下的热浸法测定,以乙醇作为溶剂,计算供试品中醇溶性浸出物的含量。

1.2.4 酒蒸炮制工艺单因素考察

1)黄酒用量考察:取等量或适量净川芎饮片5份,每份取50 g,分别加入按川芎饮片质量比5%、10%、15%、20%、25%的黄酒拌匀,先置于适宜容器内加盖浸润8 h,取出后再置于蒸制容器内,蒸制约20 min,取出,稍晾,在60 ℃下干燥。取出粉碎,过筛。测定阿魏酸含量、醇溶性浸出物,下同。

2)浸润时间考察:取经最佳黄酒用量的黄酒拌匀的川芎饮片5份,每份各50 g,置适宜容器内分别浸润4 h、6 h、8 h、10 h、12 h,取出,置蒸制容器内,蒸制20 min,稍晾,取出,置干燥器内60 ℃下干燥。取出粉碎,过筛。

3)蒸制时间考察:取经最佳黄酒用量与浸泡时间浸润的净川芎饮片5份,每份各50 g,置蒸制容器内,分别蒸制10 min、20 min、30 min、40 min、50 min,取出,稍晾,置干燥箱内60 ℃下干燥。取出粉碎,过筛。

4)干燥温度考察:取最佳黄酒用量、最佳浸泡时间以及最佳蒸制时间的川芎饮片5份,每份各50 g,分别采用40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃条件下干燥。取出粉碎,过筛。

1.2.5 蒸制工艺正交试验

正交试验设计:以黄酒用量(%)、浸润时间(h)、蒸制时间(min)和干燥温度(℃)四个主要影响因素,根据单因素试验结果,各因素均选取3个水平按L9(34)表设计对川芎进行酒蒸法炮制试验,优选最佳炮制工艺条件。试验因素及水平见表1。

表1 川芎酒蒸工艺正交试验因素水平

1.2.6 工艺验证

为验证优选最佳工艺的科学性、稳定性、可重复性,按正交试验优选出的最佳炮制工艺进行3批次的工艺验证,并分别对川芎生品和酒蒸品测定阿魏酸含量、醇溶性浸出物。

2 结果与分析

2.1 阿魏酸浓度的线性关系

以对照品的浓度(μg/mL)为横坐标(X),对照品的峰面积(A)为纵坐标(Y),经过回归处理,所得出的线性回归方程为Y=849.94X-0.051,r=0.9998。从而证明了阿魏酸在5.05～50.5 μg/mL浓度区域内,其浓度值与峰面积之间呈现良好的线性关系。

2.2 川芎最佳酒蒸工艺优选

2.2.1 不同因素对酒蒸川芎阿魏酸的影响

1)黄酒用量:经试验表明,在浸润时间、蒸制时间、干燥温度固定的条件下,当黄酒用量为15%时,其阿魏酸的含量最高,达到0.1347%。但随着黄酒用量的增加,川芎中阿魏酸的含量逐渐下降,故采用15%的黄酒用量较宜。

2)浸润时间:经试验表明,在黄酒用量、蒸制时间、干燥温度固定的条件下,当浸润时间为8 h时,其阿魏酸的含量最高,达到0.1278%。但随着浸润时间的增加,川芎中阿魏酸的含量呈逐渐下降趋势,故浸润时间为8 h较宜。

3)蒸制时间:经试验表明,在黄酒用量、浸润时间、干燥温度固定的条件下,当蒸制时间为20 min时,其阿魏酸的含量最高,达到0.1834%。但随着蒸制时间的延长,阿魏酸含量呈逐渐下降的趋势,故蒸制时间为20 min较宜。

4)干燥温度:经试验表明,在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃条件下干燥,当干燥温度为70 ℃时,其阿魏酸含量最高,达到0.1113%。故干燥温度为70 ℃较宜。

2.2.2 综合评分权重选择

综合评分权重选择,因阿魏酸的提取溶剂为甲醇,醇溶性浸出物的提取溶剂为乙醇,而甲醇和乙醇有很多性质非常相似,因此浸出物中可能也存在阿魏酸。试验以阿魏酸含量以及醇溶性浸出物为主要评价指标,对正交试验进行综合质量评分分析。按照所测成分的重要性,考虑阿魏酸含量占60%的权重,醇溶性浸出物则占40%的权重。按阿魏酸含量评分=(某次测量阿魏酸含量/9次测量中阿魏酸含量最大值)×60%,醇溶性浸出物评分(某次测量中浸出物值/9次测量中浸出物含量最大值)×40%,综合评分=阿魏酸含量评分+醇溶性浸出物评分,满分为1.000分。正交试验及综合评分结果见表2。

表2 酒蒸川芎正交试验及综合评分结果

2.3 川芎酒蒸最佳炮制工艺

由表2中的结果进行分析可知,各因素对综合评分的影响大小顺序依次为:C(蒸制时间)>B(浸润时间)>A(黄酒用量)>D(干燥温度),得到酒蒸川芎的最佳炮制工艺为A3B2C1D3,即取质量为50 g的川芎饮片,加入质量比20%的黄酒混合拌匀,置适宜容器内浸润约8 h,取出,置蒸制容器内,蒸制10 min,取出稍晾,于70 ℃下干燥。

2.4 川芎酒蒸最佳炮制工艺验证

在最佳工艺条件下,进行3批次的工艺验证,结果阿魏酸平均含量为0.182%,RSD为1.981%;醇溶性浸出物的平均含量为28.872%,RSD为1.213%。通过3批次的工艺验证,结果差异性较小,阿魏酸含量及浸出物测定值均符合2020版《中国药典》规定,表明该工艺稳定,可靠。

3 讨论

2020版《中国药典》规定川芎以阿魏酸含量作为的质量控制指标,其浸出物也是衡量饮片质量的重要指标。本实验通过优化流动相的比例和冰乙酸溶液的浓度进行优化比较,选择用甲醇-0.1%冰乙酸(30∶70)作为流动相,色谱柱柱温在30 ℃时,阿魏酸色谱峰峰形和分离效果较好。单因素考察中发现,随着黄酒用量的增加、浸润时间的加长、蒸制时间的延长,川芎中阿魏酸的含量逐渐下降,其原因有待进一步研究。由正交试验综合评分结果可知,蒸制时间的影响最大,其次为浸润时间、黄酒用量、干燥温度。本研究仅是对酒蒸川芎贵州特色炮制工艺优选的研究,酒蒸川芎炮制方法对其炮制前后化学成分的影响未进行对比研究,可在此研究基础上进一步展开相关研究。

4 结论

川芎具有活血行气、散瘀止痛、祛风燥湿的功效。临床主要将其用于治疗心脑血管系统、呼吸系统、泌尿系统、肝肾功能及妇科方面的疾病[13]。酒蒸川芎贵州特色炮制方法一直应用于药物生产中。正交试验是常用的试验设计方法,本试验通过前期单因素考察,选定正交试验中各因素水平进行优选,采用L9(34)正式试验设计及综合分析评分法进行分析,最终优选出酒蒸川芎最佳工艺为:取净川芎饮片,加入20%的黄酒,浸润8 h后,置于容器内蒸制10 min,取出,在70 ℃温度下干燥。通过验证试验表明,在该工艺条件下阿魏酸含量稳定,平均含量为0.182%,醇溶性浸出物平均含量为28.872%,综合质量评分为0.979。证明该工艺安全有效,稳定可行。