分光光度法测定竹叶提取物中总黄酮含量的改进*

吴 阳,范秀章,李荣华

(贵州省分析测试研究院,贵州 贵阳 550014)

竹叶为中医一味传统的清热解毒药材,在中国民间广为使用。近年来人们围绕竹叶开展了大量工作,研究表明竹叶提取物中黄酮类化合物药理活性明显[1-3]。但针对竹叶提取物总黄酮含量的实际检测工作中发现采用的方法存在一些疑问:

第一,竹叶提取物为混合物,其中含有很多杂质,检测过程中试剂溶液本身呈黄色(颜色深浅由样品含量决定),检测波长下有吸收,导致选用硝酸铝-醋酸钾显色体系,测定结果偏高;第二,现有黄酮含量测定方法均以芦丁为标准品,但竹叶黄酮中不含芦丁,其主要成分为碳苷黄酮[4-5],分子量均比芦丁小,分子结构差异也较大,采用芦丁作为比较标准,结果不准确;第三,在选用现有黄酮测定标准[6]如DB 34/T 2743—2016进行竹叶黄酮含量测定过程中,测定值比实际偏低,由于标准曲线线性关系良好,考虑可能是显色剂用量不够,样品显色不够彻底,导致结果不准确。

本文针对以上特点,选用氢氧化钠环境下,氯化铝-亚硝酸钠显色体系,以竹叶黄酮中典型碳苷异荭草苷作为标准品,同时增加显色剂用量,对竹叶提取物中总黄酮含量的测定作了粗浅的分析与探讨。改进后的方法提高了结果的稳定性、准确性。从实验结果可看到:在浓度0～40 mg/L范围内,芦丁、异荭草苷标准曲线的相关系数(r2)分别为0.9999,0.9998,平均加标回收率为97.93%、99.65%,RSD为1.35%、0.7%(n=6)。说明该改进方法满足检测要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦丁(C27H30O16,CAS号:153-18-4,纯度≥99.0%),异荭草苷(C21H20O11)购于成都德思特生物科技有限公司,亚硝酸钠,氯化铝,氢氧化钠,实验试剂为分析纯;实验室用水为 GB/T 6682规定的三级水。

实验用试样竹叶提取物购买于浙江圣氏生物科技有限公司,紫外检测总黄酮含量≥ 24.0%。

1.2 仪器与设备

723S型可见分光光度计,上海棱光技术有限公司;Agilent1200高效液相色谱仪,美国安捷伦公司,Agilent XSE205DU型电子天平,梅特勒-托利多;比色管等试验仪器。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

称取5 g(精确至0.0001 g)样品粉末于100 ℃烘箱烘至恒重,得出样品水分。

1.3.2 试剂溶液的制备

亚硝酸钠溶液(5%):5 g亚硝酸钠,用水完全溶解定容至100 mL;氯化铝溶液(10%):10 g氯化铝,用水搅拌溶解定容至100 mL;氢氧化钠溶液(4%):4 g氢氧化钠,用水搅拌溶解定容至100 mL;乙醇溶液(60%):600 mL无水乙醇加水定容至1 L。

1.3.3 标准溶液的制备

芦丁、异荭草苷标准储备液:分别准确称取10 mg(精确到0.1 mg)芦丁和异荭草苷标准样品于50 mL容量瓶中,加60%乙醇溶液溶解后,定容至标线,摇匀。此溶液中标准样品含量为200 mg/L,于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3.4 芦丁、异荭草苷标准曲线的制作:

分别吸取芦丁、异荭草苷标准储备液0.0 mL、0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.3 mL、1.5 mL、1.8 mL、2.0 mL于一组10 mL比色管中,加乙醇溶液至总体积为4 mL,加亚硝酸钠溶液0.3 mL,混匀,静置8 min;再加入氯化铝0.8 mL,摇匀,静置10 min,加入氢氧化钠4.5 mL,用乙醇溶液定容至刻度,摇匀,静置10 min。用1 cm比色皿,测定510 nm波长处的吸光度。以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,计算线性方程和相关系数。

1.3.5 试样溶液的制备

称取0.05 g样品(精确到0.1 mg)于50 mL容量瓶中,用乙醇溶液溶解后,定容至标线,摇匀。

1.3.6 试样的测定

准确吸取0.5 mL待测液于10 mL比色管中,加乙醇溶液至总体积为4 mL,加亚硝酸钠溶液0.3 mL,混匀,静置8 min;再加入氯化铝0.8 mL,摇匀,静置10 min,加入氢氧化钠4.5 mL,用乙醇溶液定容至刻度,摇匀,静置10 min。用1 cm比色皿,测定510 nm波长处的吸光度。

以未加氢氧化钠试剂的溶液为空白,测定其吸光度值,根据标准曲线计算样品中总黄酮的浓度。

1.3.7 结果计算

竹叶黄酮中总黄酮含量(以干基计),以百分率表示,按下式计算:

式中:X—竹叶黄酮中总黄酮的百分含量;c—由标准曲线计算得出待测样品溶液的总黄酮浓度mg/L;c0—由标准曲线计算得出的空白溶液的总黄酮浓度(mg/L);10—待测液稀释倍数;m—竹叶黄酮的质量(g);0.05—竹叶黄酮试样液总体积(L);H—竹叶黄酮试样水分的质量分数(%)。

2 结果分析

2.1 标准曲线

分别测定芦丁、异荭草苷系列标准工作液,并制作标准曲线,计算线性方程和相关系数。两个系列标准工作液吸光度值列于表1,线性方程和相关系数列于表2。

表1 芦丁、异荭草苷系列标准工作液测定结果

表2 芦丁、异荭草苷标准曲线线性方程、相关系数

结合表1、表2数据可知,将方法改进后,两标准品均线性关系良好。通常认为当线性相关系数(r2)大于0.99时,浓度与吸光度之间有显著的线性相关性。实验数据表明,两者线性相关性皆良好,但从吸光度值看,异荭草苷灵敏度更高。

2.2 方法精密度试验

取同一份制备好的试样溶液,共6份,分别采用芦丁、异荭草苷标准曲线,对竹叶提取物试样按“1.3.6”方法进行显色操作,测定其浓度,计算其黄酮含量与RSD,结果见表3。

表3 方法精密度实验结果

2.3 加标回收试验

准确称取竹叶提取物试样0.0300 g,按“1.3.5”制备试样溶液,加入质量浓度为200 mg/L的芦丁或异荭草苷标准溶液,按“1.3.6”项的操作方法进行显色,进行2个浓度点的三水平加标回收试验,测得总黄酮浓度及回收率,实验数据见表4。

表4 样品加标回收率试验

由表4可知,以芦丁为标准品进行加标回收试验,回收率在97% ～ 99.17%之间,平均回收率为97.93%;以异荭草苷为标准品进行加标回收试验,回收率在96.90% ～ 104.2%之间,平均回收率为99.65%。表明芦丁与异荭草苷均可作为标准品,但是异荭草苷准确度更高。

2.4 高效液相色谱法

称取购买到的竹叶提取物样品,结合文献报道对竹叶黄酮的成分分析,采用高效液相色谱仪,对试样进行11种黄酮类混合标准物质含量的测定,并进行加和计算黄酮总量。

由图1,表5可知,采用高效液相色谱法对市售竹叶黄酮进行检测,进行加和计算得到的总黄酮含量为7.3405 mg/g。

图1 竹叶黄酮中总黄酮高效液相色谱图

表5 高效液相色谱法测定结果

综上,试验结果表明,改进后的分光光度法,选用异荭草苷做标准品,其结果与高效液相色谱法的更接近。

3 结论

本文对分光光度法测定竹叶黄酮含量进行了改进,并与高效液相色谱法结果进行了比较。结果表明,选用异荭草苷作为标准品,加大显色剂用量,结果准确度更高。