中波紫外线通过抑制Hippo 通路促进AKT 磷酸化致日光性角化病发病机制研究

雷皓雪，钟雨环，李红宾，杨智，杨正慧

（昆明医科大学第一附属医院皮肤科，云南 昆明 650000）

日光性角化病（actinic keratosis，AK）与患处长期反复日光暴露有关，是云南地区常见的皮肤癌前病变，皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma，cSCC）可能与患处长期反复日光暴露有关。以往研究认为，PI3K/Akt /mTOR 通路参与并诱发AK及cSCC［1-2］。YAP 是Hippo 通路的核心效应因子，抑制Hippo 通路可活化YAP，而YAP 通过活化AKT通路发挥促进cSCC 生长及恶性生物学行为的癌基因作用［3］。因此本实验通过UVB 照射HaCaT 细胞、A431 细胞，抑制YAP 表达，观察Hippo 通路、AKT通路的变化，阐述UVB 对AK 发生发展的调控机制，进而明确UVB 照射对AK 的影响。

1 资料与方法

1.1 组织标本 本研究选取2019 年3 月至2022 年3 月就诊于昆明医科大学第一附属医院，经病理学确诊为AK（AK 组）患者9 例和cSCC（cSCC 组）患者10 例。参加研究的所有患者及其家属均知情同意。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：组织病理HE 检查确诊AK 及cSCC 诊断。排除标准：有心血管疾病、糖尿病、肾功能不全等基础疾病者；合并其他皮肤肿瘤患者；有肿瘤、免疫抑制性疾病患者；有家族遗传性疾病患者。

1.3 主要试剂和仪器 TaKaRa Prime Script II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（D6210A） 试 剂 盒；TaKaRa SYBRPremix Ex TaqTMII（Perfect Real Time）试剂盒。细胞培养试剂：胎牛血清（Hyclone，Cat. No. SH30087.01）；DMEM-高糖培养基（Hyclone，Cat. No. SH30022.01B）；MEM α（Gibco，Cat.No. 12571063 ）； 青 链 霉 素（Hyclone，Cat. No.SH30010）；PBS 磷 酸 钾 缓 冲 液（Gibco，Cat. No.10010023）；Trypsin-EDTA（0.25%）phenol red（Gibco，Cat. No. 25200056）。苏州安泰洁净工作台（SW-CJIFD）；低速离心机（中佳，SC3614）；倒置光学显微镜（Olympus 公司）；细胞恒温培养箱（Thermo Scientific 公司）；倒置荧光显微镜（Leica 公司）。

1.4 方法

1.4.1 免疫组化染色法 石蜡包埋组织，将皮肤组织制作成3~5µm 厚的组织切片，将组织切片在60℃烤箱烤片30~60min，后将组织切片脱蜡水化，将组织切片置于盛满柠檬酸（pH 6.0）抗原修复液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，在血清封闭后，于切片上分别滴加一抗YAP、AKT 抗体室温孵育3h。在二抗山羊抗兔抗体室温孵育50min，以DAB 显色，苏木素复染细胞核，后封片、镜检，以Image J 检测切片吸光度，并用Graph pad 进行统计分析制图。

1.4.2 UVB 照射 将细胞以适当浓度（1×105-6/孔）接种至6 孔板中，37℃、5% CO2温箱中培养过夜，使细胞贴壁，密度70%～75%。用移液枪将培养液吸出，加入PBS 洗涤3 次后，每孔加入500µL PBS 覆盖细胞，防止细胞干燥。每孔分别用不同能量照射，照射能量=单位照射能量×时间，根据能量计算照射时间。1孔予相同处理，不照射UVB 作为空白对照。

1.4.3 细胞转染 转染前一天对细胞株进行传代，使其汇合度为30%～50%，siRNA 工作浓度为50nM，使 用24 孔 板，吸 取siRNA 母 液（20µM）1.25µL溶解 到100µL Opti-MEM 培 养 基 为A 液，取1µL LipofectamineTMRNAiMAX 溶解于Opti-MEM 培养基为B液，B 液混合5min 后，A 液和B 液混合，静置20min后加到细胞培养板中，孵育4h 后换为细胞生长培养基。细胞共分为3 组：Cell 组（不加任何处理），NC 组（加入空白siRNA），YAPsiRNA 组（加入YAPsiRNA ）。

通过PCR 试验方法对6 组细胞的YAPmRNA 表达水平进行检测，通过Western blot 方法、细胞免疫荧光法检测细胞中的YAP 表达。

1.4.4 RT-PCR 检测 用Trizol 法提取总RNA，按照反转录试剂盒反转录为 cDNA 后，PCR 扩增yap 基因片段，分别为：YAP-F，5’TGTCTTACACCGTGCTGCCA 3’，YAP-R：5’AGGTCAGTACAGAGGGCATCGT 3’；18S-F：5’CCTGGATACCGCAGCTAGGA 3’，18S-R：5’GCGGCGCAATACGAATGCCCC 3’。内参片段：18S-112bp。反应条件：94℃变性 4 min；94℃变性 30 s、60℃退火 30 s、72℃延伸 30 s，进行30 个循环； 最后一次循环后 72 ℃延伸10 min。PCR 产物凝胶成像，电泳图像采用Dec 2000 凝胶成像系统（ Bio-Rad 公司）分析。

1.4.5 QRT-PCR 检测 反转录的 cDNA 进行 QRTPCR。反应体系为20µL：SYBRPremix Ex TaqTM（2×）10 µL，PCR Forward Primer（10µM）0.8µL，PCR Reverse Primer（10µM）0.8µL，cDNA 模 板2µL，dH2O 6.4µL。反应参数按TaKaRa SYBRPremix Ex TaqTMII（Perfect real time）试剂盒说明进行，置于Bio-Rad CFX96 荧光定量PCR 仪扩增，运用Bio-Rad CFX Manager Software1.6 数据分析软件进行分析，且采用2^-（ΔΔCt）法来计算。

1.4.6 蛋白免疫印迹法 裂解细胞，收集裂解液并离心收集到上清液。用BCA 法测量蛋白浓度，行SDSPAGE 电泳分离，结束后转至 PVDF 膜上，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1h。1 ∶1000 稀释的一抗4℃孵育过夜，TBST 溶液洗膜3 次后加入 1 ∶1000 稀释的二抗37℃孵育1 h，TBST 溶液洗膜3 次，发光液发光，显影，凝胶成像系统扫描图像，用Image Pro 分析软件分析条带积分光密度值。

1.4.7 细胞免疫荧光 PBS 洗去培养液的细胞4%多聚甲醛固定30min； PBS 洗 3 次，每次5min，0.2%Triton X-100 透化细胞膜 5 min，PBS 洗 3 次，每次5min，10%正常山羊血清封闭30min，一抗4℃孵育过夜，PBS 洗3 次，每次5min。荧光标记二抗（1：200）室温湿盒避光孵育1 小时，PBS 洗3 次，每次5min；DAPI 室温湿盒避光孵育5min；PBS 洗1 次，5min，水洗2 次，每次5min；荧光抗淬灭剂封片，显微镜下观察和图像采集。

1.5 统计学方法 采用 SPSS 27.0 软件进行数据的统计分析。用均数±标准差表示正态分布的计量资料，采用两两独立样本t检验对AK 组和cSCC 组AKT 及YAP 的表达量进行差异性分析，采用单因素方差分析，对不同细胞组（临床参数的分类在3 类以上）中不同蛋白表达量进行差异性分析，后用图基检验进一步进行多重比较。P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化结果 AK 组9 例，cSCC 组10 例。AKT在AK 表皮的细胞质及细胞间隙中均呈阳性表达，基底层较为明显。AKT 在cSCC 表皮全层及突破基底层的表皮的细胞质及细胞间隙中均有阳性表达，且AKT在cSCC 中表达量明显高于AK（P＜0.05）。YAP 在AK、cSCC 表皮的细胞质及细胞核中均呈阳性表达，在基底层中最为明显，在cSCC 突破基底层的表皮中也更为明显，见图3。YAP 在cSCC 中表达量明显高于AK（P＜0.01）。在AK 及cSCC 表皮中，YAP 表达量与AKT 在AK、cSCC 中均呈正相关（rAK2=0.6858，rAK=0.8297，PAK＜0.01，rcSCC2=0.3398，rcSCC=0.6661，PcSCC＜0.05），见图1、图2。

图1 免疫组化检测AkT、YAP 在cSCC 中的表达

图2 免疫组化检测在AK 及cSCC 中YAP 与AKT 的相关性

图3 免疫组化检测AKT、YAP 在AK、cSCC 中的表达

2.2 UVB 照射促进HaCaT 细胞中YAP 表达 相同照射时间，HaCaT 细胞中YAP 的表达随光照剂量增加（P＜0.01）。相同照射时间，随光照剂量增加，HaCaT细胞中YAP 磷酸化受抑制增强（P＜0.01），见图4。

2.3 细胞转染降低HaCaT 细胞、A431 细胞yap 基因相对表达、YAP 表达量 Cell 组为未转染质粒的细胞，NC 组为转染空白质粒的细胞，通过细胞转染使HaCaT 细胞、A431 细胞中YAP siRNA 组yap 基因、YAP 表达量较cell 组、NC 组均明显降低，差异均具有统计学意义（PHaCaT＜0.01，PA431＜0.01）。通过细胞免疫荧光法观察到细胞转染使HaCaT 细胞、A431 细胞中YAP 表达量较cell 组、NC 组均明显降低，见图5、图6。

图6 细胞免疫荧光法检测HaCaT 细胞、A431 细胞各3 个组的结果

2.4 UVB 照射抑制A431 细胞中Hippo 通路 通过细胞转染抑制A431 细胞中YAP 表达后，UVB 照射可抑制A431 细胞中Hippo 通路。UVB 照射抑制HaCaT细胞中Hippo 通路。通过细胞转染抑制HaCaT 细胞中YAP 表达后，UVB 照射可抑制HaCaT 细胞中抑制Hippo 通路。UVB 照射促进A431 细胞中AKT 磷酸化，差异具有统计学意义（P＜0.05）。通过细胞转染方法抑制A431 细胞中YAP 的表达后，AKT 磷酸化被抑制，差异具有统计学意义（P＜0.01），再次照射UVB后，AKT磷化被抑制的情况有所缓解（P＜0.01）。UVB 照射促进HaCaT 细胞中AKT 磷酸化，差异具有统计学意义（P＜0.05）。通过细胞转染方法抑制HaCaT 细胞中YAP 的表达后，AKT 磷酸化被抑制，差异具有统计学意义（P＜0.01），再次照射UVB 后，AKT 磷化被抑制的情况有所缓解（P＜0.01），见图7、图8。

图7 UVB 照射对A431 细胞中Hippo 通路、AkT 通路的影响

图8 UVB照射对HaCaT细胞中Hippo通路、AkT通路的影响

3 讨论

AK 是cSCC 的癌前期皮肤损害，然而AK 转化为cSCC 的发病机制仍不明确，目前普遍认为与紫外线长期照射导致DNA损伤、基因突变、信号通路变化、氧化应激等有关［4-5］。

YAP 是Hippo 信号通路的转录共激活因子，当Hippo 通路活化时，MST1/2 与接头蛋白（Salvador，Sav）、RAS 相关域家族（RASSF）蛋白相结合，磷酸化激活LASTS1/2，而LASTS1/2 与MOB1 结合磷酸化YAP，而使YAP 潴留于细胞质并降解失活［6］；相反去磷酸化的YAP 可转入并累积在核内，YAP 的N 端与TEAD 家族（TEA domain family）结合，形成转录因子复合物，诱导表达目标基因。在皮肤鳞癌（cSCC）中表达量明显高于光线性角化病（AK），YAP 在AK 中表达量明显高于正常皮肤［10］，过表达的YAP 参与AK 和cSCC 的发生、发展。YAP 可能通过促进皮肤鳞癌细胞在G1/S 期增殖并抑制癌凋亡以增强其迁移、侵袭能力，YAP 在转录过程中可通过诱导AREG 的表达活化EGFR/RAS 信号通路，进而活化其下游的P13K/AKT 通路及ERK 通路［3］。

YAP 在口腔鳞状细胞癌组织及口腔鳞状癌细胞中过表达，且表达量与口腔鳞状细胞癌的恶性程度及癌细胞的增殖呈正相关［7］。过表达YAP 基因可以通过PI3K/AKT/mTOR 信号通路促进舌鳞癌细胞增殖并抑制细胞凋亡。

激活皮肤鳞癌细胞A431 内PI3K-AKT 通路，可促进其增殖，这可能是皮肤鳞癌的发病机制［11］。在转移性鳞癌的治疗中，同时使用Akt 抑制剂和自噬抑制剂能增加化疗敏感性［8］。

紫外线作用于EGFR 引起 PI3K/Akt/mTOR 信号通路过度激活，激活程度cSCC 高于AK 高于正常皮肤［9］。成纤维细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor ，FGFR）通过活化mTOR 在UVB 照射引起cSCC 中发挥作用［9］。

本实验通过免疫组化检测提示cSCC 中YAP 和AKT 表达量均高于AK，与既往的研究［9-10］相符，且AKT 表达量与YAP 正相关。进一步通过细胞实验发现，在HaCaT 细胞和A431 细胞中，UVB 照射促进YAP 表达，抑制YAP 磷酸化，且表达水平、磷酸化水平与光照剂量正相关，提示UVB 照射活化YAP信号通路。通过细胞转染方法敲减HaCaT 细胞和A431 细胞中YAP 表达水平，观察到AKT 磷酸化受抑制，而UVB 照射可抑制Hippo 通路进而活化YAP并促进AKT 磷酸化。因此我们推测，UVB 照射通过抑制Hippo 通路促进YAP 表达，进而促进AKT 磷酸化，提示这可能是AK 和cSCC 的发生机制。本研究也存在一定局限性，本研究样本量小，可能存在一定程度的偏倚，仍需进一步扩大及完善样本量加以验证；本实验没有对cSCC 进行免疫组化检测，仅观察了Hippo 通路、AKT 磷酸化的变化，未能进一步研究其对细胞功能的具体影响。