钙蛋白酶2通过诱导三阴乳腺癌细胞上皮间质转化抵抗紫杉醇的机制探讨

陈聪，吴元肇，郑克思，应文兵，胡逸人

三阴性乳腺癌是具有较强侵袭性表型的乳腺癌亚型，易复发和转移，且无法进行内分泌治疗和人表皮生长因子受体2 靶向治疗［1-2］。化学治疗仍然是三阴性乳腺癌的重要治疗手段，但随着治疗的推进，肿瘤细胞逐渐出现药物抵抗而产生继发性耐药，最终导致治疗失败［3］。因此，如何解决药物抵抗具有重要临床意义。钙蛋白酶-2（Calpain-2）是广泛表达于人体的钙蛋白酶家族成员，其主要通过蛋白水解活性发挥其生物学作用［4］。研究显示，Calpain-2在肾细胞癌［5］、乳腺癌［6］、胰腺癌［7］等多种恶性肿瘤中发挥作用，参与调控细胞侵袭、迁移及转移。此外，Calpain-2 还在肺癌［8］和结直肠癌［9］化疗抵抗中发挥重要作用。但在三阴性乳腺癌中，Calpain-2与药物抵抗的关系及相关机制还不清楚。本研究通过外源性过表达Calpain-2，观察其在三阴性乳腺癌细胞抵抗紫杉醇（PTX）中的作用及机制，为临床治疗提供基础理论支持。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞购自南京科佰生物科技有限公司；Calpain-2过表达质粒和空载质粒购自上海和元生物技术有限公司；脂质体2000 购自上海Invitrogen 公司；DMEM 高糖培养基、青-链霉素混合液、噻唑蓝（MTT）购自北京索莱宝科技有限公司。Calpain-2 抗体、E-钙黏蛋白（E-cadherin）抗体、N-钙黏蛋白（N-cadherin）抗体、波形蛋白（Vimentin）抗体、yes 相关蛋白（YAP）抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体购自武汉云克隆科技股份有限公司；小鼠抗人大肿瘤抑制基因1（LATS1）抗体、p-LATS1抗体、p-YAP抗体、山羊抗小鼠IgG抗体及山羊抗小鼠IgG（H+L）Alexa Fluor 488 二抗购自上海爱必信生物科技有限公司；YAP抑制剂XMU-MP-1购自美国MCE公司；胎牛血清（FBS）购自美国Gibco 公司。多功能酶标仪（型号SpectraMax 190）购自美国Molecular Devices 公司；全自动数码凝胶成像分析仪（型号Tanon 2500）购自上海天能公司；高速低温离心机（型号AllegraTM21R）购自美国贝克曼公司；倒置荧光显微镜（型号IX71）购自日本奥林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、转染及分组 将MDA-MB-231 细胞接种于含10%FBS和1%青-链霉素混合液的高糖DMEM培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞，以1×105个/孔接种于6 孔板中培养过夜。次日，将10 µL Calpain-2过表达质粒和空载质粒加入100µL高糖DMEM培养基中，并静置5 min。各向100µL 高糖DMEM 培养基中加入20µL脂质体2000，并静置5 min。将各质粒稀释液与脂质体2000稀释液混匀静置20 min。取出细胞，弃去旧培养基并以PBS 清洗，加入上述混合液，补加800µL 高糖DMEM 培养基，置于培养箱培养10 h。而后更换为全培养基继续培养。将转染Calpain-2过表达质粒和空载质粒的细胞设为过表达组和空载体组，同时以不做转染的正常细胞作为空白组。蛋白质免疫印迹实验对Calpain-2蛋白表达进行验证。

1.2.2 MTT 法检测细胞存活率 细胞以8 000 个/孔接种于96孔板中，以0、1、5、15、25、50 nmol/L PTX 处理细胞48 h，同时，以DMSO 处理细胞作为溶剂对照，以未处理的细胞作为空白对照。药物处理结束后每孔加入15µL MTT（5 g/L）溶液于培养箱孵育4 h。弃去培养液，加入150µL MDSO 溶解结晶后检测570 nm波长处吸光度值，实验重复3次。细胞存活率（%）=（实验孔-空白对照孔）/（溶剂对照孔-空白对照孔）×100%。计算细胞存活率为50%时的药物浓度，即半数抑制浓度（IC50）。

1.2.3 免疫荧光法检测细胞YAP 蛋白分布 将细胞接种于35 mm激光共聚焦专用培养皿中，过表达组和空载体组细胞转染10 h后，细胞更换全培养基继续培养24 h。弃去旧培养基，以4%多聚甲醛和免疫组织细胞通透液分别处理10 min。细胞以10%正常山羊血清封闭1 h 后，于4 ℃孵育YAP 抗体过夜。次日洗去一抗并孵育IgG（H+L）Alexa Fluor 488 二抗1 h，PBST 洗去二抗后加入DAPI 避光孵育5 min。细胞用PBST 洗3 遍，滴加抗荧光猝灭封片液封片，于荧光显微镜下成像并拍照。实验重复3次。

1.2.4 蛋白质免疫印迹实验检测蛋白表达 3 组细胞用含1×蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液裂解细胞10 min。在4 ℃、14 000×g离心20 min 并收集上清液。采用BCA蛋白定量法检测上清液蛋白浓度，随后以蛋白上样缓冲液制备蛋白样品。样品经SDS-PAGE 电泳和转印法将蛋白分离并转印至PVDF 膜上。将载有蛋白的PVDF 膜于4 ℃孵育Calpain-2（1∶1 000）、E-cadherin（1∶2 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、LATS1（1∶1 000）、p-LATS1（1∶1 000）、p-YAP（1∶1 000）及YAP（1∶1 000）抗体过夜。次日洗去一抗后孵育对应山羊抗兔IgG抗体或山羊抗小鼠IgG抗体1 h。去除二抗后用ECL化学发光试剂盒在凝胶成像仪下对蛋白条带进行成像。实验重复3次。

1.2.5 XMU-MP-1 干预 以XMU-MP-1（1 µmol/L）处理过表达组细胞24 h 作为XMU-MP-1+过表达组，同时培养空载体组和过表达组细胞作为对照。MTT 法检测PTX 对各组细胞存活的影响，蛋白质免疫印迹实验检测N-cadherin、Vimentin和E-cadherin蛋白表达。实验重复3次。

1.3 统计学方法 以Graphpad 7.0 软件进行数据分析。计量数据以均数±标准差（）表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，组间多重比较使用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Calpain-2 增强MDA-MB-231 细胞抵抗PTX 空载体组Calpain-2 蛋白表达与空白组差异无统计学意义，而过表达组Calpain-2蛋白表达高于空载体组（P＜0.05），见图1A、B。PTX 处理后空白组和空载体组细胞存活率差异无统计学意义，但与空载体组相比，过表达组细胞存活率升高（P＜0.05），见图1C。计算PTX 对各组细胞的IC50发现，过表达组IC50高于空载体组（P＜0.05），见图1D。

Fig.1 Role of Calpain-2 in the resistance of triple-negative breast cancer cells to PTX图1 Calpain-2在三阴性乳腺癌细胞抵抗PTX中的作用

2.2 Calpain-2 诱导三阴性乳腺癌细胞EMT 相较于空白组，空载体组E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin 蛋白表达差异无统计学意义；与空载体组相比，过表达组细胞N-cadherin 和Vimentin 蛋白表达上调，E-cadherin 蛋白表达下调（P＜0.05），见图2。

Fig.2 Effect of Calpain-2 on EMT of triple-negative breast cancer cells图2 3组细胞EMT相关蛋白表达水平变化

2.3 Calpain-2 诱导YAP 磷酸化及胞浆转移 相较于空白组，空载体组p-LATS1和p-YAP蛋白表达差异无统计学意义；与空载体组相比，过表达组p-LATS1 和p-YAP 蛋白表达上调（P＜0.05），见图3。与空载体组相比，过表达组细胞核内YAP 分布减少，见图4。

Fig.3 Effect of Calpain-2 on the expression of YAP图3 Calpain-2对YAP表达的影响

Fig.4 Effect of Calpain-2 on the distribution of YAP(immunofluorescence,×400)图4 Calpain-2对YAP蛋白分布的影响（免疫荧光染色，×400）

2.4 抑制表达YAP 可逆转Calpain-2诱导的三阴性乳腺癌细胞EMT 与过表达组相比，XMU-MP-1+过表达组N-cadherin 和Vimentin 蛋白表达下调，E-cadherin蛋白表达上调（P＜0.05），见图5。

Fig.5 Role of YAP inhibition in Calpain-2 induced EMT in triple negative breast cancer cells图5 抑制YAP在Calpain-2诱导三阴性乳腺癌细胞EMT中的作用

2.5 抑制YAP 可逆转Calpain-2诱导的三阴性乳腺癌细胞PTX 抵抗 PTX 处理后，与过表达组相比，XMU-MP-1+过表达组细胞存活率降低（P＜0.05），见图6A。XMU-MP-1+过表达组IC50低于过表达组（P＜0.05），见图6B。

Fig.6 Inhibition of YAP in Calpain-2-induced PTX resistance in triple-negative breast cancer cells图6 抑制YAP在Calpain-2诱导的三阴性乳腺癌细胞PTX抵抗中的作用

3 讨论

药物抵抗是三阴性乳腺癌治疗失败的主要原因之一。Calpain-2 已被证实在恶性肿瘤化疗药物抵抗中发挥作用。研究显示，Calpain-2通过表皮生长因子受体（EGFR）-磷酸化蛋白激酶B（pAKT）通路增强非小细胞肺癌对PTX的化疗抵抗［8］。还有研究报道，Calpain-2 依赖性的核因子κB 抑制因子α（IκBα）降解介导了结直肠癌异种移植中的盐酸伊立替康耐药［9］。本研究发现，外源性过表达Calpain-2 可增强三阴性乳腺癌细胞抵抗PTX。这与文献报道［8］结果相类似，但Calpain-2 的相关信号机制还不清楚。上皮间质转化（EMT）是肿瘤细胞获得更强迁移和侵袭能力的重要生物学过程［10］。目前，大量研究显示，肿瘤细胞EMT 参与化疗药物抵抗。Cheng等［11］发现，G蛋白结合蛋白1通过磷酸激酶1激活的EMT 信号在非小细胞肺癌中促进厄洛替尼的抵抗。卵巢癌相关研究显示，lncRNA CHRF 通过miR-10b诱导的EMT和信号转导和转录激活因子3信号激活参与卵巢癌顺铂抗抵抗［12］。而在三阴性乳腺癌中，EMT 在介导TGF-β 诱导的抗药性中发挥重要作用［13］。本研究显示，与空载体组相比，Calpain-2 过表达组间质标志物N-cadherin和Vimentin蛋白表达上调，上皮标志物E-cadherin 蛋白表达下调，提示Calpain-2可能诱导三阴性乳腺癌细胞EMT。

YAP 是Hippo 信号通路的核心效应因子，在肿瘤生物学活动中发挥重要作用。目前，YAP 的生物学作用尚存争议，其细胞核表达存在抑癌和促癌两种观点。部分研究显示，YAP 被上游蛋白LATS1/2磷酸化后定位于细胞质并最终降解，而去磷酸后，YAP转运到胞核内发挥促癌作用［14-15］。另有研究发现，YAP细胞核表达与肿瘤细胞恶性程度呈负相关，主要发挥抑癌作用［16-17］。本研究发现，Calpain-2 过表达组MDA-MB-231 细胞YAP 磷酸化和细胞浆表达增加。为验证YAP 胞浆表达的潜在作用，本研究继续观察了XMU-MP-1 的干预作用。XMU-MP-1作为化学合成的小分子化合物，可阻断MST1/2-LATS1/2 通路磷酸化，从而诱导YAP 从细胞浆易位至细胞核内［18］。本研究结果发现，XMU-MP-1预处理可逆转Calpain-2 诱导的MDA-MB-231 细胞PTX抵抗。提示Calpain-2 诱导的YAP 胞浆表达促进了PTX抵抗，Calpain-2在MDA-MB-231细胞中起促癌作用。同时，本研究还发现XMU-MP-1预处理可逆转Calpain-2 过表达诱导的MDA-MB-231 细胞EMT，提示YAP参与介导Calpain-2诱导的三阴性乳腺癌细胞EMT。

综上，Calpain-2过表达可诱导MDA-MB-231细胞对PTX 抵抗，而该作用与YAP 介导的EMT 有关。本研究揭示了Calpain-2 诱导三阴性乳腺癌细胞化疗抵抗的作用及其机制，完善了对Calpain-2生物学功能的认识，可为临床治疗提供基础理论支持。