顶空气质联用法鉴别不同发育期蚕豆花挥发性成分

徐晓俞，李程勋，陈常飞，潘 键，侯明香，李爱萍*

(1.福建省农业科学院作物研究所, 福建 福州 350013; 2.连江县丹阳镇飞常家庭农场, 福建 福州 350503; 3.福鼎市花千树农业科技有限公司,福建 福鼎 355200; 4.永泰县川山生态农业有限公司, 福建 福州 350700)

蚕豆ViciafabaL.是人类最早栽培的豆类作物之一，在我国已有2000多年的栽培历史。蚕豆是世界第七大食用豆类作物，近年来，中国蚕豆种植面积达130多万hm2，占世界总面积的45.7%，为世界第1蚕豆生产大国[1]。蚕豆在全国大多数省份都可种植，分为秋播区和春播区。在福建，蚕豆以秋播为主，是重要的冬种经济作物，常年种植面积达到4万hm2左右。蚕豆花为蚕豆的干燥花，是民间传统中药材，性平、味涩、无毒[2]。中医认为，蚕豆花具有凉血、止血的功效，可用于治疗咳血、鼻衄、血痢、带下、高血压病等[3-4]。蚕豆在开花过程中常采取人工摘除每花序中的无效小花，以减少花朵的营养竞争，提高结荚率，可采摘鲜花约2250 kg·hm-2，摘除的蚕豆花未被很好的利用，造成资源的浪费[2]。关于蚕豆花挥发性成分的研究报道较少，仅见蚕豆花精油化学成分的报道。傅桂香等[5]利用水蒸气蒸馏提取蚕豆花精油，采用毛细管气相色谱-质谱联用技术分析了蚕豆花精油的化学成分，发现蚕豆花主要成分为醇类和酸类。目前开展较多的研究主要有蚕豆花非挥发性化学成分的提取、分离、鉴定、检测。郭向群等[3]首次从蚕豆花中分离、鉴定出槲皮素和山奈酚，并建立HPLC检测方法。左旋多巴是治疗帕金森病的药物，在蚕豆花、茎、叶、荚壳、种皮、子叶等部位均有分布，以蚕豆花中的含量最高[2]，不同花色[2]、不同品种[6]间含量具有显著差异。蚕豆花气微香，在发育的过程中逐渐释放出挥发性成分，而关于不同发育期蚕豆花挥发性成分的研究还未见报道，这对于了解蚕豆花挥发性成分的变化规律，明确挥发性成分的生物功能都有重要的指导意义。本研究以福蚕1号蚕豆花为研究材料，采用顶空-气质联用法鉴别不同发育期蚕豆花挥发性成分及其相对含量，对蚕豆花挥发性成分进行分析和鉴定，比较不同发育期挥发性成分的差异，以期为蚕豆花挥发性成分的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料福蚕1号蚕豆花于2022年3月5日采自福建省福州市连江县丹阳镇蚕豆种植基地，并于当日运往福建省农业科学院科研综合实验中心进行检测。

1.2 试验仪器

主要有Thermo Scientific TSQ 9000三重四级杆气相质谱联用仪(美国赛默飞世尔科技公司)和Thermo Scientific TriPlus 300顶空自动进样器(美国赛默飞世尔科技公司)。

1.3 试验设计

分别采集花蕾期、初开期、盛开期、凋谢期4个发育期的蚕豆花，用于检测挥发性成分，各设3个生物学重复。将采集的蚕豆花放入20 mL顶空瓶中，待测。

1.4 试验方法

顶空条件：炉温90℃，腔温110℃，传输线温度135℃，样品瓶平衡时间5 min。

色谱条件：TG-5SilMS色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样量1 mL，载气为纯氦气(99.99%)，恒流模式，流量1.2 mL·min-1，分流流量14.0 mL·min-1，分流比12∶1；程序升温：柱温起始温度50℃保持5 min，以5℃·min-1升温至160℃，再以10℃· min-1升温至250℃保持5 min。总程序时间42 min。

质谱条件：进样口温度250℃；电离方式EI，离子源温度300℃；质谱全扫描方式，扫描质量范围30～550 amu。

1.5 数据分析

测定的气相色谱峰根据色谱保留时间，对比NIST 2019标准谱库中的质谱信息对每个成分进行初步鉴定，并结合参考文献定性，以谱库匹配度大于80%作为定性标准。每个成分的物质含量以相对含量表示，运用峰面积归一化法，求得各成分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 不同发育期蚕豆花的挥发性成分分析

不同发育期蚕豆花挥发性成分总离子流图见图1。

注：A为花蕾期；B为初开期；C为盛开期；D为凋谢期

2.1.1蚕豆花总挥发性成分分析 由表1可知，从蚕豆花中共分离鉴定出35种挥发性成分，包括醇类、酯类、醛类、酮类、萜烯类、烷烃类、芳香族类、生物碱类成分。从花蕾期、初开期、盛开期、凋谢期蚕豆花中分别鉴定出12、14、18、20种挥发性成分，相对总含量分别为80.90%、83.46%、81.53%、84.56%。蚕豆花花蕾期相对含量较高的挥发性成分有苯乙醇、正己醛、溴化香叶酯、蘑菇醇，分别为20.86%、17.98%、12.96%、9.89%；初开期相对含量较高的挥发性成分有正己醛、溴化香叶酯、蘑菇醇，分别为26.22%、21.96%、7.36%；盛开期相对含量较高的挥发性成分有β-蒎烯、正己醛，分别为22.36%、16.18%；凋谢期相对含量较高的挥发性成分有β-蒎烯、正己醛、苯甲醛、苯乙醇，分别为16.80%、13.55%、13.31%、8.31%。

表1 不同发育期蚕豆花挥发性成分及其相对含量

2.1.2不同发育期蚕豆花的挥发性成分差异 不同发育期蚕豆花挥发性成分总相对含量相近，均达到80%～85%，因此可用相对含量来比较不同发育期蚕豆花各挥发性成分的含量差异。(1)蚕豆花醇类物质中相对含量较高的成分有蘑菇醇和苯乙醇。随着蚕豆花发育时间的延长，蘑菇醇相对含量逐渐降低，以花蕾期相对含量最高，达9.89%，在凋谢期降至2.68%；苯乙醇相对含量呈先下降后上升趋势，以花蕾期相对含量最高，达20.86%，在盛开期降至最低，为2.63%，在凋谢期上升至8.31%。(2)蚕豆花中仅检测到两种酯类成分，分别是溴化香叶酯和丁酸芳樟酯。蚕豆花从花蕾期进入初开期，溴化香叶酯的相对含量由12.96%上升为21.96%，但在盛开期和凋谢期未检测到。丁酸芳樟酯在花蕾期未检测到，随着蚕豆花发育时间的延长，丁酸芳樟酯的相对含量由初开期1.02%逐渐上升为凋谢期4.35%。(3)蚕豆花醛类物质中相对含量较高的挥发性成分有正己醛和苯甲醛。随着蚕豆花发育时间的延长，正己醛相对含量呈先上升后下降趋势，由花蕾期17.98%上升为初开期26.22%，后逐渐下降至凋谢期13.55%。花蕾期和初开期的蚕豆花未检测到苯甲醛，盛开期相对含量为5.74%，在凋谢期上升至13.31%。(4)蚕豆花中仅检测到两种酮类成分。随着蚕豆花发育时间的延长，3-辛酮相对含量呈逐渐降低趋势，以花蕾期相对含量最高，达3.67%，在凋谢期已检测不到。7-亚甲基双环[3.2.0]庚-3-烯-2-酮仅在凋谢期检测到，相对含量为1.84%。(5)蚕豆花中共检测到3种萜烯类成分。随着蚕豆花发育时间的延长，β-松油烯相对含量呈先上升后下降趋势，以初开期相对含量最高，达1.67%。花蕾期和初开期的蚕豆花未检测到β-蒎烯，盛开期相对含量为22.36%，进入凋谢期降至16.80%。花蕾期和初开期的蚕豆花未检测到α-香柠檬烯，盛开期相对含量为2.86%，进入凋谢期上升至3.60%。(6)蚕豆花烷烃类成分中相对含量较高的成分为2-氨基-5-甲基己烷，随着蚕豆花发育时间的延长，2-氨基-5-甲基己烷相对含量呈先上升后下降趋势，在盛开期相对含量最高，达5.78%。(7)蚕豆花中仅检测到两种芳香族类成分。氢化安息香仅在花蕾期检测到，相对含量为2.62%。苯基-1，2-乙二醇环状亚硫酸盐相对含量随着蚕豆花发育时间的延长而逐渐上升，但在凋谢期未检测到。(8)蚕豆花中检测到4种生物碱类成分，相对含量均较低。

2.2 不同发育期蚕豆花挥发性成分种类

由表2可知，发育期蚕豆花挥发性成分均以醇类的数量最多，随着蚕豆花发育，醇类成分的数量呈逐渐上升趋势。从种类的相对含量上分析，花蕾期和初开期均以醇类、酯类、醛类成分为主，盛开期和凋谢期均以醇类、醛类、萜烯类成分为主。醇类相对含量呈先下降后上升趋势，以花蕾期相对含量最高，达34.06%，酯类相对含量呈先上升后下降趋势，以初开期相对含量最高，达22.98%，醛类相对含量总体上呈上升趋势，以凋谢期相对含量最高，达30.96%，萜烯类成分在花蕾期未检测到，相对含量呈先上升后下降趋势，以盛开期相对含量最高，达26.86%。总的来说，醇类、酯类、醛类、萜烯类成分是蚕豆花的主要挥发性物质，对蚕豆花气味具有重要贡献。随着蚕豆花发育时间的延长，挥发性成分的数量逐渐增加，种类也更加多样。

表2 不同发育期蚕豆花挥发性成分种类及其相对含量

3 讨论

植物次生代谢产物是植物对环境的一种适应，是在长期进化过程中植物与生物和非生物因素相互作用的结果。蚕豆是常异花授粉作物，平均异交率在30%左右，主要靠蜂类虫媒传粉，而虫媒的采蜜行为是异花授粉的主要途径[7]。因此，蚕豆在开花过程释放的挥发性成分可能与吸引昆虫前来采蜜有关。

蚕豆花中的主要挥发性成分蘑菇醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香气[8]，研究表明蘑菇醇对传粉昆虫中华蜜蜂有吸引作用[9]。随着蚕豆花发育，蘑菇醇的相对含量从花蕾期的9.89%下降到凋谢期的2.68%，而蚕豆花授粉期主要在花蕾期和初开期进行，需要传粉昆虫进行传粉，到了盛开期和凋谢期蚕豆花已完成授粉并结荚，因此随着蚕豆花发育，通过花香对虫媒的吸引需求减弱，蘑菇醇相对含量也随之下降。蚕豆花释放的挥发性成分可能也与防御外来病原微生物、害虫有关。苯乙醇具有清甜的玫瑰样花香[10]，研究表明苯乙醇是用于眼用溶液的一种防腐剂，对各种细菌和真菌具有抑制作用[11]，在蚕豆花发育过程中相对含量呈先下降后上升趋势，可能与开花前期保护花蕾安全授粉与开花后期保护幼荚防御病菌有关。丁酸芳樟酯具有类似香柠檬的香气，稀释后具有类似蜂蜜、柑橘的香气[12]，是红脉穗螟等害虫驱避剂的主要成分之一[13]。在蚕豆花花蕾期未检测到丁酸芳樟酯，随着蚕豆花进一步发育，丁酸芳樟酯的相对含量呈逐渐上升趋势，至凋谢期达到4.35%，对蚕豆幼荚起到防御害虫的作用。正己醛具有青草气及粗青气[14]，是蜜蜂用来辨识与自己亲缘关系较近工蜂的重要化学气味[15]，在蚕豆花花蕾期、初开期授粉阶段表现出较高的相对含量，以吸引虫媒传粉。苯甲醛具有苦杏仁香、甜香气、新鲜和轻飘的果香[16]，对真菌生长有明显的抑制作用，对果蔬具有保鲜效果[17]。苯甲醛是植物防御害虫的重要信息物质[18]，还能引诱天敌寄生蜂对寄主昆虫进行定位，减少植食性昆虫为害，从而达到间接防御的目的[19]，仅在蚕豆花盛开期、凋谢期检测到，且相对含量呈上升趋势，起到防御害虫和吸引害虫天敌的作用。3-辛酮具有果实香味，常用于薰衣草香型香精的勾兑。据报道，3-辛酮是紫花苜蓿吸引访花昆虫进行花粉传播的主要挥发性成分[20]。本研究结果表明3-辛酮在蚕豆花花蕾期相对含量最高，之后呈逐渐下降趋势，在凋谢期检测不到，表明其在蚕豆花授粉阶段主要起到吸引传粉昆虫的作用。芳香性萜烯类物质不仅能保护植物免受细菌、真菌和寄生虫等的侵害，对人类健康亦有广泛的积极作用[21]。β-松油烯是一种单萜类香气成分，具有花香或果实香，对支气管有温和的刺激作用，吸入作为祛痰剂[22]。β-蒎烯是一种单萜类香气成分，具有干木香、树脂香[23]。研究显示，β-蒎烯具有抑菌活性，对柑橘青霉病菌具有较好的抑制效果[24]，对沙门氏菌也有抑制活性[25]，具有作为天然食品防腐剂的潜力。同时，β-蒎烯是一种重要的植物防御物质[26]。β-蒎烯在蚕豆花花蕾期和初开期未检测，而在盛开期和凋谢期相对含量较高。α-香柠檬烯是一种倍半萜类香气成分，具有微弱木香气味[27]，与植物间接防御有关[28]，仅在盛开期和凋谢期检测到，且相对含量呈上升趋势。因此可以推测β-蒎烯、α-香柠檬烯等萜烯类物质在蚕豆开花后期主要对幼荚起到防御害虫和微生物侵害的作用。

4 结论

本研究从蚕豆花中共分离鉴定出35种挥发性成分，包括醇类、酯类、醛类、酮类、萜烯类、烷烃类、芳香族类、生物碱类成分。随着蚕豆花发育时间的延长，挥发性成分逐渐释放，挥发性成分的数量逐渐增加。醇类成分的相对含量呈先下降后上升趋势，酯类成分的相对含量呈先上升后下降趋势，醛类成分的相对含量总体上呈上升趋势，萜烯类成分的相对含量呈先上升后下降趋势。研究结果表明，醇类、酯类、醛类、萜烯类是蚕豆花的主要挥发性物质，对蚕豆花主体气味具有重要贡献，这些挥发性成分的产生是蚕豆长期进化过程适应环境的结果，在蚕豆花的发育过程中，开花授粉阶段的挥发性成分主要起到吸引虫媒的作用，而在结荚后的盛花期和凋谢期主要起到抵御病原菌和害虫侵害的作用。凋谢期蚕豆花挥发性成分丰富，可提取用于开发昆虫引诱剂、驱避剂或植物源天然保鲜剂。