超表达CsCslE1_4基因对烟草细胞壁成分的影响

姚新转, 李倩倩, 吕立堂,2

(1.贵州大学茶学院, 贵阳 550025;2.贵州大学生命科学学院/农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室, 贵阳 550025)

细胞壁是使植物细胞轮廓具有一定大小和硬度、同时具有一定弹性的组织。细胞壁为植物提供水分以及养料、构建植物形态,与细胞分化和植物生长发育密切相关[1]。植物细胞壁在协调抵御植物与外界环境中的生物胁迫和非生物胁迫方面起重要作用[2-3]。研究发现,在许多植物的脆性突变体中发现植物的纤维素含量下降,细胞壁结构发生改变,更容易引起植株断裂。如在不规则木质部突变体中,细胞壁组织成分的空间构造随着细胞次生壁中的纤维素含量下降发生改变,导致成熟植株茎秆的机械强度下降[4]。在水稻中发现的bcl-2基因的脆性突变体,出现了茎、叶的脆性,在进一步研究中发现纤维素含量降低[5]。Samuga等[6]对杨树PtrCslD2基因进行研究,发现PtrCslD2与木质部中纤维素合成有关。Nawaz等[7]研究发现,Csl还参与抵抗非生物应激反应,如冷、热和盐胁迫。类纤维素合酶基因的功能以及之间的相互作用关系尚未清楚。因此,研究类纤维素合成酶E(CsIE)基因在纤维发育过程中的作用机制,有利于在分子水平上改良纤维品质,增加植物细胞壁的强度,并影响细胞和植物生长的方向[8]。本实验通过对CsCslE1_4基因进行功能分析验证,分析其对细胞壁成分中纤维素、半纤维素和木质素含量的影响,为选育和栽培调控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烟草(NicotianatabacumL.)品种“Xanthin”由贵州大学茶学院实验室提供,烟草种植条件为温度(24±1)℃,相对湿度60%,光照16 h,黑暗8 h。RAN提取试剂盒、反转录试剂和荧光定量试剂盒购买于北京华越洋生物科技有限公司。

1.2 CsCslE1_4基因过表达载体构建

使用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切质粒载体pSH737,用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切合成的目的片段,以T4DNA连接酶连接,构成植物表达载体,β-葡萄糖苷酸酶基因(β-glucuronidase,GUS) 融合基因作为报告基因。

1.3 茶树CsCslE1_4基因的遗传转化

利用农杆菌介导的叶盘法进行烟草遗传转化[9]。在培养皿中抗性筛选后,通过PCR以及GUS组织染色鉴定得到阳性转基因植株,用于后续试验。

1.4 CTAB法提取烟草总RNA以及cDNA制备

以烟草叶片为材料,采用CTAB法提取总RNA。取0.1 g样品,研磨成细粉迅速转移至RNA提取缓冲液中。水浴10 min,冷却至室温,离心后上清液转移至新离心管中,加入等体积的水饱和酚和氯仿(比例25∶24)和10 mL NaCl,离心,加入等体积的异丙醇和2倍体积的NaCl,-80 ℃过夜沉淀。离心去上清,乙醇清洗沉淀,加适量RNA Free ddH2O溶解,即得总RNA。根据试剂盒说明书操作将RNA反转录为cDNA用于下一步荧光定量PCR。

1.5 转CslE1_4基因烟草表达量检测

利用CsCslE1_4-F:ATGTCACTGTCCCATCTCTTTG,CsCslE1_4-R:CGCCTAAGCTGTATCCGTATTT,以烟草β-actin基因作参照,设计引物Nt-actin-F:TGAGATGCACCACGAAGCTC,Nt-actin-R:CCAACATTGTCACCAGGAAGTG。根据试剂盒上的使用说明进行荧光定量分析。每个样本设置3个重复。采用2-△△Ct法计算基因的相对表达量。

1.6 烟草细胞壁成分测定

1.6.1细胞壁多糖成分的提取

参照文献[10]的测定方法,称取0.05 g(干重)样品使用磷酸缓冲液研磨至匀浆,反复用磷酸缓冲液洗涤研钵和研棒,离心。沉淀中依次加入氯仿-甲醇(体积比1∶1)去除脂类、DMSO-H2O(体积比9∶1)提取淀粉,蒸馏水清洗,残渣即为粗细胞壁,备用。果胶以半乳糖醛酸含量制作标准曲线,比色法测定糖醛酸吸光值并计算相应的果胶含量;半纤维素含量以木糖为标准糖制作标准曲线,比色法测定戊糖,并计算相应半纤维素含量;纤维素含量的测定以葡萄糖含量制作标准曲线,采用蒽酮-硫酸法计算相应的纤维素含量,比色法测定己糖。

1.6.2木质素含量测定

参照刘佳佳[11]的乙酰溴法,以280 nm处的吸光值表示每克鲜样中木质素的相对含量。每个样品3个生物学重复。

1.7 数据处理

实验数据使用Excel和GraphPad Prism5.0软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 CslE1_4基因的克隆与转基因株系的获得

以茶树叶片cDNA为模板,以特异性引物扩增得到CslE1_4序列,克隆得到的CslE1_4序列与过表达载体pSH737连接,构成植物表达载体pSH737-CsCslE1_4(图1)。

图1 CsCslE1_4基因过表达载体构建图谱

通过农杆菌介导法,将含有CsCslE1_4重组质粒的农杆菌菌液对烟草叶片遗传转化,获得18株转基因烟草(图2 A～图2 D)。对烟草进行GUS组织化学染色以及PCR鉴定,结果(图2 E、F)发现,在GUS染液中,野生型烟草植株并未检测到GUS活性,在抗性烟草植株中检测到GUS活性;经PCR鉴定,阳性转基因植株有一条大小约120 bp的条带(图2 F),阴性对照中并未扩增出目的条带,说明CslE1_4基因已经成功整合到烟草中。

2.2 转CslE1_4基因烟草株系的表达量分析

通过RT-qPCR分析转基因株系中CslE1_4基因的表达量(图3)。结果发现,18株转基因烟草株系中CslE1、CslE6、CslE13、CslE17的表达量分别是野生型的19.06倍、13.50倍、6.73倍和5.18倍,差异极显著(图3),其他株系中CslE16表达量最低。

注:WT为野生型烟草;CslE为转基因烟草,误差线表示3个重复的标准偏差;“*”表示差异显著(p<0.05);“**”表示差异极显著(p<0.01)。下同。

2.3 纤维素含量

对转CslE1_4基因烟草的叶片与茎段的纤维素含量进行测定,结果(图4)显示,除株系CslE4外,转基因株系茎中纤维素含量都显著高于同株系叶中的纤维素含量,其中差异最大的是株系CslE2,茎段纤维素含量是叶片纤维素含量的7.17倍。同时,与野生型相比,转基因株系茎的纤维素含量是野生型的1.43～5.48倍,叶中纤维素含量除株系CslE2外,其余株系纤维素含量是野生型的1.08～2.49倍。由此可见,大多数转基因株系,其纤维素含量相对较高,部分可能是由于CslE1_4基因表达低。

图4 转基因烟草的纤维素含量

2.4 半纤维素含量

转CslE1_4基因烟草的叶片和茎段的半纤维素含量测定结果(图5)显示,每个株系的半纤维素含量变化与纤维素含量趋势基本一致。除株系CslE4外,野生型和转基因株系茎中的半纤维素含量均高于同株系的叶片。与野生型相比,转基因株系叶中纤维素含量除株系CslE2和CslE10外,其余株系半纤维素含量是野生型半纤维素含量的1.18～2.22倍,其中含量最高的株系为CslE4;茎中半纤维素含量是野生型半纤维素含量的1.47～5.74倍,含量最低的株系是CslE6,最高的株系是CslE2。

图5 转基因烟草半纤维素含量

2.5 果胶含量

野生型和转基因烟草的果胶含量测定结果(图6)表明,茎段中的果胶含量比叶片低,转基因烟草果胶含量在叶与茎中均比野生型烟草果胶含量高。转基因株系叶中果胶含量是野生型的1.08～1.84倍,其中含量最低的株系是CslE9,最高的是CslE4。茎中转基因株系果胶含量是野生型的1.29～3.67倍,含量最低的株系是CslE2,最高的是CslE14。同时发现,同一株系的纤维素和半纤维素含量增高时,果胶含量存在补偿性的降低,即果胶含量变化趋势与纤维素和半纤维素含量变化趋势相反。

图6 转基因烟草果胶含量

2.6 木质素含量

采用乙酰溴测定木质素含量法,测定过表达转CslE1_4基因烟草叶片中的木质素(图7)。以野生型烟草为对照,在叶片中CslE1的木质素含量最高,是野生型烟草的1.09倍。茎段中CslE10的木质素含量最高,是野生型的1.05倍。其余转基因烟草木质素含量在叶片中均有一定程度的提高,而在茎段中呈降低的趋势。结果表明,转CslE1_4基因对烟草的木质素含量没有太大影响。

图7 转基因烟草的木质素含量

3 讨 论

细胞壁是植物适应和生存的关键,能够调节植物的生长发育,其主要成分包括纤维素和半纤维素[12]。本研究通过对野生型和转基因烟草进行基因表达以及细胞壁成分测定,发现与野生型烟草相比,过量表达后的转基因烟草的细胞壁多糖成分含量均有提高,如纤维素、半纤维素和果胶。转基因烟草的茎段比叶片的纤维素和半纤维素提高更加明显,果胶含量较叶片降低,木质素含量没有明显的变化。

纤维素是植物细胞壁重要的组成成分之一,在本研究中,与野生型相比,转基因株系纤维素含量高于野生型烟草。在油菜(Brassicacampestris)[13]、大豆(Glycinemax)[14-15]研究中也有类似结果;高纤维素含量可提高植株的机械强度,增强抗倒伏能力[16-17]。一般认为,半纤维素与纤维素形成的交联结构可提高细胞壁强度,从而提高植株的抗倒伏能力[18-19]。本研究发现,野生型和转基因株系茎和叶片中的半纤维素含量均高于野生型烟草,其中茎半纤维素含量高于同株系叶片半纤维素含量。参与木聚糖合成的IRX14H基因[20]与维持木聚糖含量和稳定细胞壁的IRX15-L基因均在直立性好的品种中表达量较高[21]。因此,结合基因表达量以及转基因烟草的半纤维素含量结果分析,推测在烟草茎发育中,半纤维素合成相关基因表达量增加,导致半纤维素含量增加。果胶作为初生细胞壁的主要组成物质,对植物细胞的形态建成具有重要作用[22]。随着纤维的发育,各果胶前体核苷糖含量均有下降趋势。纤维品质极好的陆地棉品系的果胶含量明显低于品质较差的品系[23]。在细胞壁多糖成分测定结果中,转基因烟草的纤维素、半纤维素含量的变化趋势基本一致,果胶含量则相反。并且,转基因株系在叶片中的纤维素和半纤维素含量均降低,果胶含量补偿性增加;而茎段纤维素含量和半纤维素含量均升高,果胶含量反而降低。本研究认为,低含量的果胶可以增加细胞壁的硬度,从而提高烟草的硬度。

4 结 论

CslE1_4基因可能与植物中纤维素合成有关,调控植物中纤维素的形成,影响植物中细胞壁组成成分含量。本研究结果可为烟草及其他作物品种在选育和栽培上提供理论依据。