Galectin-4调控PD-L1影响CD8+T细胞杀伤肝癌细胞的功能

魏晓环 单前前 刘媛媛

作者单位：221000 徐州1徐州市中心医院肿瘤科；221006 徐州2徐州医科大学第二附属医院疼痛科；221000 徐州3徐州市中心医院呼吸科

肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤，目前肝癌的主要治疗方式为手术、化疗、肝脏移植、免疫治疗等［1-2］。其中，免疫治疗是近年来发展迅速且治疗效果显著的一种治疗方式，例如，PD-1/PD-L1 等免疫检查点抑制剂可有效促进CD8+T 细胞等免疫细胞对肿瘤的杀伤作用［3］，并且已经在临床上取得了显著的治疗效果。但是肝癌的肿瘤微环境复杂，肿瘤细胞高表达PD-L1可能对抗T 细胞的抗肿瘤活性，促进肿瘤的免疫逃逸［4］。因此，探索调控CD8+T 细胞肿瘤杀伤功能的机制，有助于发现肿瘤免疫治疗新靶点。

半乳糖凝集素（Galectin）是一类糖粘合蛋白家族，属于癌症相关蛋白［5-6］。人半乳糖凝集素4（Galectin-4，Gal-4）是Galectin 家族成员之一，能调控多种肿瘤的生长和转移。有研究报道，Gal-4 可促进胃癌转移［7］和诱导胰腺癌细胞的免疫逃逸及T 细胞凋亡［8］。但是Gal-4 影响CD8+T 细胞抗肿瘤活性的机制尚未清楚。本研究旨在探讨Gal-4在肝癌细胞中的表达及其对CD8+T细胞抗肿瘤活性的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

人正常肝细胞WRL68和肝癌细胞SMMC-7721均购自美国ATCC 公司，肝癌细胞HepG2、Hep3B、Huh-7均购自中国科学院上海细胞库；RPMI-1640 培养基和青链霉素混合液（100×）均购自江苏凯基生物科技有限公司；CD8+T细胞分离试剂盒购自美国Biolegend 公司；CD8-FITC、CD80-PE、CD83-PE、CD14-FITC、同型对照抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司；Gal-4、PD-L1、GAPDH、山羊抗鼠IgG抗体均购自美国Invitrogen公司；细胞毒性试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自天津安诺瑞康生物技术有限公司；LipofectamineTM3000 转染试剂盒购自美国赛默飞世尔科技公司；Gal-4 siRNA 及其阴性对照购自苏州吉玛基因股份有限公司；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、白介素-4（interleukin-4，IL-4）、白介素-2（interleukin-2，IL-2）均购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司。

1.2 细胞培养

WRL68、HepG2、SMMC-7721、Hep3B 和Huh-7 细胞均培养于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）及1%青链霉素混合液的RPMI-1640 培养基中，细胞置于5% CO2、37 ℃的培养箱中，待细胞汇合度达80%时进行细胞传代。

1.3 CD8+T细胞的分离与鉴定

取100 µL 人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），按照CD8+T 细胞分离试剂盒说明书，加入10 µL Biotin-Antibody Cocktail 混匀，4 ℃孵育15 min，加入10µL Streptavidin Nanobeads 溶液，混匀后4 ℃孵育15 min，再加入2 mL PBS 缓冲液，于磁力架上静置5 min，收集上清液，1 800 r/min 离心5 min，所得沉淀为CD8+T 细胞，用含有10% FBS 及100 U/mL IL-2的RPMI-1640培养基培养。取1×105个CD8+T 细胞，分别加入5 µL CD8-FITC 抗体及同型对照抗体共孵育15 min，用无菌PBS溶液清洗1次后，使用流式细胞仪检测细胞CD8表达情况。

1.4 DC细胞的提取与鉴定

收集人PBMC，用含10% FBS、10 ng/mL GM-CSF、2 ng/mL IL-4 的RPMI-1640 培养基培养，每2 d 进行1 次半换液，培养约1 周后，培养基中加入1 ng/mL 的脂多糖继续培养24 h，诱导形成成熟的DC 细胞。取1×105个DC 细胞，与5µL CD80-PE 抗体、CD83-PE 抗体、CD14-FITC抗体及同型对照抗体共孵育15 min，使用流式细胞仪检测细胞CD14、CD80和CD83表达情况。

1.5 细胞分组、转染和共培养

取对数生长期的HepG2 和SMMC-7721 细胞，按照LipofectamineTM3000 转染试剂盒说明书操作，将Gal-4 siRNA 及其阴性对照分别转染至细胞中，记为si-Gal-4组和si-NC组，培养48 h后收集细胞。

将DC 与CD8+T 细胞以1∶5 的比例共培养于含10% FBS 的RPMI-1640 培养基中，48 h 后获取DC 活化的CD8+T 细胞。将si-NC 组和si-Gal-4 组的HepG2和SMMC-7721 细胞与上述DC 活化的CD8+T 细胞以30∶1 的比例共培养18 h，分别记为：si-NC/HepG2+CD8+T 组、si-Gal-4/HepG2+CD8+T 组、si-NC/SMMC-7721+CD8+T组、si-Gal-4/SMMC-7721+CD8+T组。

1.6 细胞毒性实验

按“1.5”的共培养体系，将各细胞于96 孔板中共培养18 h 后，根据细胞毒性试剂盒说明书，每孔加入10 μL 乳酸脱氢酶释放试剂，混匀后静置30 min，离心收集各孔上清液，置于新的96孔板中，检测各孔吸光度值（optical density，OD值），肿瘤细胞裂解率=（ODE+TODE-ODT）/（ODEmax-ODE）×100%。ODEmax为CD8+T细胞全部裂解时的OD 值，ODE和ODT为各组肿瘤细胞和T 细胞单独培养孔的OD 值，ODE+T为si-NC/HepG2+CD8+T 组、si-Gal-4/HepG2+CD8+T 组、si-NC/SMMC-7721+CD8+T 组、si-Gal-4/SMMC-7721+CD8+T组各孔的OD值。

1.7 ELISA检测细胞因子

收集si-NC/HepG2+CD8+T 组、si-Gal-4/HepG2+CD8+T 组、si-NC/SMMC-7721+CD8+T 组、si-Gal-4/SMMC-7721+CD8+T 组细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书加入40µL 各上清液和10µL 生物素标记抗体于铺好一抗的96 孔板中，然后加入100 µL 辣根过氧化物酶标记抗体，37 ℃孵育75 min，清洗96 孔板后加入显色剂显色，于450 nm 波长处测吸光度，根据标准曲线计算干扰素（interferon-γ，INF-γ）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量。

1.8 Western blot检测细胞中Gal-4、PD-L1的表达水平

根据蛋白裂解试剂盒提取si-NC 组和si-Gal-4 组的HepG2 和SMMC-7721 细胞总蛋白，取10 μg 蛋白质进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，将PVDF膜与Gal-4（1∶1 000）、PD-L1（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）抗体于4 ℃孵育过夜，次日洗膜后与山羊抗鼠IgG 抗体室温孵育1 h，洗膜后使用ECL 试剂盒显影。以GAPDH为内参，采用Image J 软件分析蛋白质条带灰度值。

1.9 统计学方法

使用GraphPad Prism7.0 软件处理数据及绘制图形，所有数据以均值±标准差表示，两组间比较采用独立样本t检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CD8+T细胞与DC细胞鉴定结果

流式细胞术检测结果（图1）显示，分选的CD8+T细胞CD8 表达水平为99.0%。提取的DC 细胞中标志蛋白CD80 和CD83 表达水平均在90%以上，而CD14表达水平仅为0.08%，说明T 细胞和DC 细胞提取成功，可用于后续研究。

图1 T细胞和DC细胞鉴定结果Fig.1 The results of T cells and DC cells identification

2.2 Gal-4蛋白在肝癌细胞中高表达

Western blot检测结果显示，相比于人正常肝细胞WRL68，肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、Hep3B、Huh-7中Gal-4蛋白表达水平均显著上调（均P＜0.001），并且在HepG2 和SMMC-7721 细胞中Gal-4 表达水平最高，见图2。因此，本研究选择HepG2细胞和SMMC-7721细胞转染siRNA抑制Gal-4表达，结果显示，相比于si-NC组，si-Gal-4 组HepG2 和SMMC-7721 细胞中Gal-4 蛋白表达水平均显著下调（均P＜0.001，图3），说明成功构建干扰Gal-4的HepG2和SMMC-7721细胞株。

图2 正常肝细胞和肝癌细胞中Gal-4的表达情况Fig.2 Expression of Gal-4 in normal liver cells and liver cancer cells

图3 干扰Gal-4后HepG2和SMMC-7721细胞中Gal-4的表达情况Fig.3 Expression of Gal-4 in HepG2 and SMMC-7721 cells after interference with Gal-4

2.3 抑制Gal-4促进CD8+T细胞毒性因子的分泌

ELISA检测结果（图4）显示，相比于si-NC/HepG2+CD8+T组，si-Gal-4/HepG2+CD8+T组细胞上清液中INF-γ和TNF-α浓度均显著增加（均P＜0.001）；同样，相比于si-NC/SMMC-7721+CD8+T 组，si-Gal-4/SMMC-7721+CD8+T组细胞上清液中INF-γ和TNF-α 浓度均显著增加（均P＜0.001），说明抑制肝癌细胞Gal-4 的表达时，共孵育体系中CD8+T 细胞分泌的INF-γ 和TNF-α 显著增加。

图4 HepG2和SMMC-7721细胞上清液中INF-γ和TNF-α浓度Fig.4 The concentration of INF-γ and TNF-α in HepG2 and SMMC-7721 cell supernatants

2.4 抑制Gal-4促进CD8+T细胞的杀伤能力

CD8+T 细胞杀伤能力检测结果（图5）显示，相比于si-NC/HepG2+CD8+T 组，si-Gal-4/HepG2+CD8+T 组HepG2 细胞裂解率显著增加（P＜0.001）；同样，相比于si-NC/ SMMC-7721+CD8+T 组，si-Gal-4/ SMMC-7721+CD8+T组SMMC-7721细胞裂解率显著增加（P＜0.001），说明抑制Gal-4 可促进CD8+T 细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

图5 抑制Gal-4促进CD8+T细胞杀伤HepG2和SMMC-7721细胞Fig.5 Inhibition of Gal-4 promoted CD8+T cells to kill HepG2 and SMMC-7721 cells

2.5 抑制Gal-4下调肝癌细胞PD-L1的表达

Western blot 检测结果（图6）显示，相比于si-NC组，si-Gal-4 组HepG2 和SMMC-7721 细胞PD-L1 蛋白相对表达量显著下调（P＜0.001），说明抑制Gal-4 可显著抑制PD-L1的表达。

图6 干扰Gal-4后HepG2和SMMC-7721细胞中PD-L1的表达情况Fig.6 Expression of PD-L1 in HepG2 and SMMC-7721 cells after interference with Gal-4

3 讨论

近年来，以嵌合抗原受体T 细胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）治疗和PD-1/PD-L1 等免疫检查点抑制剂为代表的免疫疗法给肿瘤治疗带来了极大突破［9］。在肿瘤的发生发展过程中，T 细胞是对抗肿瘤的主要免疫细胞之一，但是肿瘤微环境调控机制复杂，可通过多种途径抑制T 细胞的抗肿瘤功能［10］。本研究发现抑制肝癌细胞中Gal-4 表达可抑制肿瘤细胞PD-L1 表达，进而增强CD8+T 细胞的肿瘤杀伤功能。

Gal-4在多种肿瘤中高表达，且与非小细胞肺癌、肺腺癌、胆管癌等肿瘤的转移及复发密切相关［11］。还有研究报道，过表达Gal-4 可促进肝癌细胞在体内和体外的生长［12］。本研究发现，相比于正常肝细胞，Gal-4 在肝癌细胞HepG2、SMMC-7721、Hep3B、Huh-7中的表达均显著升高，其中HepG2 和SMMC-7721 细胞中Gal-4表达水平最高，提示Gal-4可能对肝癌的发生发展具有调控功能。

CD8+T 细胞是肿瘤免疫治疗中细胞毒性强大的一类淋巴细胞，初始样CD8+T 细胞受到DC 细胞的激活后分化为CD8+细胞毒性T 细胞，可通过穿孔素/颗粒酶等途径发挥抗肿瘤功能［13］。但是在肿瘤的生长过程中，CD8+T 细胞的细胞毒性被多种调控途径所逆转。在肝癌中，肿瘤细胞的蛋氨酸代谢可诱导肝癌的CD8+T细胞耗竭［14］；Hedgehog信号通路的激活可促进肿瘤相关巨噬细胞的极化而抑制肿瘤微环境中CD8+T细胞的募集［15］。因此，探索影响CD8+T细胞对肝癌细胞杀伤功能的机制将有助于促进肝癌的免疫治疗。本研究提取了人外周血的CD8+T 细胞及DC 细胞，用DC 细胞活化CD8+T 细胞后，与干扰Gal-4 的HepG2 和SMMC-7721细胞株共培养，结果发现抑制Gal-4表达后，CD8+T 细胞对肝癌细胞的杀伤能力显著增强，CD8+T细胞分泌的INF-γ 和TNF-α 浓度亦显著增加，提示肝癌细胞可能通过Gal-4抑制CD8+T细胞的杀伤能力。

在肿瘤免疫治疗中，肿瘤细胞会通过高表达PD-L1与T 细胞表面的PD-1 结合后抑制T 细胞的抗肿瘤活性，进而实现肿瘤的免疫逃逸［16］。肝癌肿瘤微环境中M1型巨噬细胞和PRDM1/BLIMP1信号轴的激活可诱导肿瘤PD-L1 高表达，从而导致肿瘤发生免疫逃逸［17-18］。有研究发现抑制PD-1/PD-L1 信号通路可有效缓解肝癌的发生发展［19］。本研究发现抑制肝癌细胞Gal-4 表达后，肝癌细胞中的PD-L1 显著下调，说明Gal-4 可能是通过调控PD-L1 的表达影响CD8+T 细胞对肝癌的杀伤活性。

综上所述，Gal-4在肝癌细胞中高表达，抑制Gal-4可能下调肝癌细胞PD-L1 的表达，进而促进CD8+T 细胞对肝癌细胞的杀伤活性。但是Gal-4调控肝癌细胞PD-L1的机制仍需进一步探索。