姜莱,姚垒,袁纯纯,叶雯馨,范京辉,钱利纯*
(1.浙江大学动物科学学院,农业农村部华东动物营养与饲料重点实验室,浙江 杭州 310058;2.杭州市农业科学研究院畜牧研究所,浙江 杭州 310021)
豆渣是一种成本低廉且富含多种营养成分的农业副产物。将豆渣直接作为畜禽饲料使用,存在不利于添加和保存、主要营养物质利用率低、抗营养因子较多、影响饲料的适口性等问题。因此,利用微生物发酵改善豆渣营养物质水平、消除其中的抗营养因子来制作发酵豆渣饲料,是一种提高豆渣利用率的有效方式。相比于豆粕,发酵豆渣适口性得到改善,同时营养物质更易被消化和吸收。因此,开发发酵豆渣兼具经济和环保的双重效益,极具研究价值。
新鲜豆渣中约含10%粗脂肪、55%粗纤维、30%粗蛋白,以及丰富的矿物质、维生素等营养物质(以风干基础计)[1]。目前已有的豆渣发酵研究中,大多选用霉菌、芽孢杆菌、酵母菌等兼具产纤维素酶和蛋白酶能力的微生物来进行发酵,而且多菌种联用的发酵效果更为显著[2-3]。发酵可有效分解豆渣中的粗纤维、粗蛋白等大分子物质,增加可溶性多糖、小分子肽、可溶性膳食纤维、黄酮类化合物等生物活性物质的含量[2-5],使豆渣的加工品质和营养物质水平得到有效提高。
在发酵豆渣领域,一些学者已经开展了通过发酵来提升豆渣品质,继而应用于畜禽养殖生产的研究。曹云等[6]在泌乳母猪日粮中添加5%发酵豆渣后发现,母猪采食量、仔猪22 日龄时的窝重和成活率均有一定程度的提高。童丹[7]以发酵豆渣替代肉牛基础饲粮中5%的豆粕,结果发现肉牛的平均日增重显著提高,料重比显著降低。薛世崇[8]以豆渣和麸皮为发酵基质,以枯草芽孢杆菌和乳酸菌联用进行发酵,结果发现发酵原料中粗纤维含量显著降低,粗蛋白含量显著提高,并且发酵原料具有芳香气味,其主要营养成分在奶牛瘤胃的降解速率显著提高。该研究为发酵豆渣在反刍动物生产应用中的研究提供了理论依据。
相关研究已初步证实豆渣经发酵后营养物质水平提高,抗营养因子含量降低,用于畜禽生产具有可行性,但目前关于发酵豆渣的应用研究主要集中在猪和水产动物上,发酵豆渣在肉鸡上的应用及效果研究鲜有报道。在前人研究的基础上,本研究拟进一步探究发酵豆渣在优良地方肉鸡品种——仙居鸡生产中的应用,研究发酵豆渣的添加对仙居鸡生长性能、营养物质表观消化率、消化酶活性、血清生化指标等的影响,评价其在仙居鸡生产中的使用效果,为发酵豆渣应用于肉鸡生产提供理论依据,并通过试验探究发酵豆渣在肉鸡实际生产中是否具有替代抗生素的作用。
鲜湿豆渣由杭州市上城区丁桥镇某豆制品加工厂提供,麦麸从市场上采购得到。发酵所用酿酒酵母和枯草芽孢杆菌菌种均由浙江大学动物科学学院饲料科学研究所提供。发酵底物的组成为m(豆渣)∶m(麸皮)=4∶1,测得的主要营养物质水平为粗蛋白16.52%、粗纤维14.63%、粗脂肪5.87%、粗灰分3.00%、总磷0.33%。菌种用量为枯草芽孢杆菌4×107CFU/g,酿酒酵母1×107CFU/g,两者在35.5 ℃、含水量65%的条件下发酵72 h。经测定,发酵产物的主要营养物质水平为粗蛋白22.84%、粗纤维8.22%、粗脂肪7.52%、粗灰分2.70%、总磷0.37%。豆渣发酵前后营养水平的变化如表1所示,发酵后粗蛋白质量分数提升38.26%,粗脂肪质量分数提升28.11%,总磷质量分数提升12.12%,粗纤维降解率为43.81%。
表1 豆渣发酵前后营养水平变化(风干基础)Table 1 Changes of nutrient levels in soybean residues before and after fermentation (air-dry basis) %
本试验选用360 羽生长状况相似、体质量相近的1日龄仙居鸡。正式试验前,将鸡舍彻底消毒,采用立体笼养方式,公母混养,人工喂料,保证自由采食和饮水,并尽量确保各组外界环境条件基本一致。将仙居鸡随机分为5组,每组6个重复,每个重复12羽。试验场所为杭州市农业科学研究院富阳双江实验基地。试验分组及相应饲粮处理如下:1)对照组T1,饲喂基础饲粮;2)抗生素组T2,饲喂添加40 mg/kg亚甲基水杨酸杆菌肽的基础饲粮;3)处理组T3,饲喂由发酵豆渣等量替代2%豆粕的基础饲粮;4)处理组T4,饲喂由发酵豆渣等量替代4%豆粕的基础饲粮;5)处理组T5,饲喂由发酵豆渣等量替代6%豆粕的基础饲粮。试验所用基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮,配方参照杭州市农业科学研究院畜禽研究所推荐的仙居鸡营养需求配制,各处理组具体配方及营养水平见表2。试验鸡只7日龄接种新城疫疫苗,14日龄接种法氏囊疫苗,21日龄接种新城疫和传染性支气管炎二联疫苗单苗。
表2 各组基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 2 Compositions and nutrient levels of basal diets in different groups (air-dry basis)
1.3.1 样品采集
在试验42 d 时,对试验鸡只(预先禁食12 h)进行称量。每组各重复中随机挑选公母鸡各1 羽,编号并屠宰。以颈部采血法采集血样于真空抗凝管中,于30 ℃下静置30 min 后,以3 000 r/min 离心15 min,取上清液置于1.5 mL Eppendorf(EP)管中,投入液氮速冻并保存,返回实验室后将血样存放于-80 ℃超低温冰箱中,待测。鸡只解剖后剪取十二指肠中间肠段约5 cm,收集新鲜肠道内容物装入1.5 mL EP 管。取十二指肠组织置于pH 7.0 的无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)中清洗3 次后,放入样品袋。取胰腺组织直接放入样品袋。肠道内容物、十二指肠组织、胰腺组织样品经液氮速冻后,于-80 ℃超低温冰箱中保存,备用。本试验获得浙江大学实验动物福利伦理审查委员会批准,遵循《浙江大学实验动物福利伦理审查委员会章程》相关规定。
1.3.2 生长性能测定
在试验开始后,定时饲喂并记录每组各重复仙居鸡的采食量,试验鸡只每周称量一次,并记录称量数据。根据各重复仙居鸡的初始(1日龄)体质量(m1)、21日龄体质量(m21)、42日龄体质量(m42)和采食量,计算平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)、平均日增重(average daily gain, ADG)和料重比(feed to gain ratio, F/G),并记录死亡鸡只的数量,以计算死亡率。
1.3.3 营养物质表观消化率测定
以三氧化二铬(Cr2O3)为指示剂,测定饲料中主要营养物质的表观消化率。在试验最后一周进行代谢试验,方法如下:在仙居鸡的饲粮中添加0.5%Cr2O3,经过4 d的预试期后,连续3 d收集仙居鸡的粪便,剔除粪便中的皮屑、羽毛和饲料颗粒后,立即加入10%的硫酸并将粪样搅拌均匀,于4 ℃冰箱中保存。代谢试验结束后,将同一重复3 d内收集到的粪样混合均匀,于65 ℃条件下烘干后,取出样品在室温下回潮,过40目筛后粉碎并制成风干样品,待测。
营养物质表观消化率(apparent digestibility,AD)计算公式为AD=(I-E)/I×100%,其中,I为饲料中某营养成分的含量,%;E为粪便中某营养成分的含量,%。饲料中粗蛋白含量参照GB/T 6432—2018测定,粗脂肪含量参照GB/T 6433—2006测定,粗灰分含量参照GB/T 6438—2007 测定,粗纤维含量参照GB/T 6434—2006 测定,钙含量参照GB/T 6436—2018 测定,总磷含量参照GB/T 6437—2018测定。
1.3.4 消化酶活性测定
将冷冻的肠道内容物和胰腺组织样品置于4 ℃冰箱中解冻,准确称取5.0 g 肠道内容物,按质量比1∶9 加入pH 7.0 的PBS 溶液,于冰水中将肠道内容物匀浆后装入1.5 mL EP 管,以2 500 r/min离心10 min,取上清液,待测。胰腺称量后同样按质量比1∶9 加入pH 7.0 的PBS 溶液,于冰水中将胰腺组织匀浆后装入1.5 mL EP 管,以2 500 r/min 离心10 min,取上清液,待测。采用南京建成生物工程研究所生产的测定试剂盒,分别检测α-淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶活性和总蛋白含量,以测定仙居鸡十二指肠和胰腺组织中消化酶活性。
1.3.5 血清生化指标测定
采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒,测定试验中采集到的血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)活性、总胆红素(total bilirubin,T-BIL)含量、白蛋白(albumin, ALB)含量、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)含量、尿酸(uric acid, UA)含量、总胆固醇(total cholesterol, TC)含量、甘油三酯(triglyceride, TG)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和钙(Ca)、锌(Zn)、铁(Fe)、磷(P)的水平。
采用SPSS 26.0 软件对试验数据进行单因素方差分析和邓肯多重比较。所有数据均表示为平均值±标准差,以P<0.05表示差异有统计学意义,P<0.01表示差异有高度统计学意义。
由表3 可知,T5组仙居鸡的42 日龄体质量和平均日增重均显著高于对照组(P<0.05),而T2、T3、T4组极显著高于对照组(P<0.01)。添加发酵豆渣提高了仙居鸡的平均日采食量,其中T3组的平均日采食量较对照组提升最多,达6.04%,但各组间无显著差异(P>0.05)。发酵豆渣的添加略微降低了仙居鸡的料重比,T3、T4、T5组的料重比较对照组分别降低了5.56%、10.13%和5.56%,其中仅T4组料重比显著低于对照组(P<0.05)。抗生素组和各发酵豆渣组仙居鸡的各项生长性能数据间均无显著差异(P>0.05)。各组间仙居鸡的死亡率无显著差异(P>0.05)。
表3 发酵豆渣对仙居鸡生长性能的影响Table 3 Effects of fermented soybean residues on the growth performance of Xianju chickens
由表4 可知,抗生素和发酵豆渣的添加对仙居鸡的粗蛋白表观消化率有一定程度的提高,其中T4组的粗蛋白表观消化率显著高于对照组(P<0.05),T5组极显著高于对照组(P<0.01),而抗生素组和各发酵豆渣组间无显著差异(P>0.05)。T4、T5组的粗纤维表观消化率相较于对照组和抗生素组显著提高(P<0.05)。各发酵豆渣组仙居鸡的粗脂肪、粗灰分、钙和总磷的表观消化率较对照组均有所提高,但无显著差异(P>0.05)。
表4 发酵豆渣对仙居鸡营养物质表观消化率的影响Table 4 Effects of fermented soybean residues on the apparent digestibility of nutrients in Xianju chickens%
由表5可知,抗生素和发酵豆渣的添加使得仙居鸡体内十二指肠、胰腺组织中主要消化酶的活性均有不同程度的提高。与对照组相比,T4组仙居鸡体内十二指肠淀粉酶活性显著提高(P<0.05),T4、T5组十二指肠蛋白酶活性极显著提高(P<0.01)。各组间十二指肠脂肪酶活性无显著差异(P>0.05)。与对照组相比,T2、T3、T5组仙居鸡体内糜蛋白酶活性显著提高(P<0.05),各组中胰淀粉酶、胰蛋白酶和胰脂肪酶的活性虽然有一定程度的提高,但差异不显著(P>0.05)。与抗生素组相比,T4、T5组十二指肠蛋白酶活性显著提高(P<0.05),此外各发酵豆渣组其他指标与抗生素组间均无显著差异(P>0.05)。
表5 发酵豆渣对仙居鸡十二指肠和胰腺消化酶活性的影响Table 5 Effects of fermented soybean residues on digestive enzyme activities in duodenum and pancreas of Xianju chickensU/mg
各组仙居鸡的血清生化指标如表6所示。从中可知,T3、T4组血清中谷丙转氨酶活性显著低于对照组(P<0.05),T3、T4、T5组血清中总胆红素含量显著低于对照组(P<0.05),T4、T5组血清中总胆红素含量还显著低于抗生素组(P<0.05)。与对照组相比,T2、T3、T5组血清中白蛋白含量均显著提高(P<0.05),T4组血清中白蛋白含量极显著提高(P<0.01)。T3、T4组血清中尿素氮含量较T1、T2、T5组均显著降低(P<0.05)。T2、T5组血清中超氧化物歧化酶活性极显著高于对照组(P<0.01),T3、T4组则显著高于对照组(P<0.05)。T2组血清中丙二醛含量极显著低于对照组(P<0.01),T3、T4、T5组则显著低于对照组(P<0.05)。在微量元素方面,各组间血清中的钙、锌、磷含量无显著差异(P>0.05),T2、T4、T5组血清中的铁含量较对照组显著提高(P<0.05)。
表6 发酵豆渣对仙居鸡血清生化指标的影响Table 6 Effects of fermented soybean residues on serum biochemical indexes of Xianju chickens
本研究发现,抗生素的使用以及不同用量发酵豆渣的添加均能显著提高仙居鸡1~42日龄的平均日增重。相比于对照组,仅T4组料重比显著降低。虽然其他组的料重比均有所降低,各组平均日采食量均有所提高,但均无显著差异。综合上述生长性能数据可得,由发酵豆渣等量替代基础饲粮中4%豆粕对仙居鸡的生长性能提升效果最佳,且优于抗生素。目前已有一些研究成果证实了发酵豆渣在家禽养殖中的积极作用。马萍等[9]发现相比于饲喂鲜豆渣,饲喂发酵豆渣时青脚麻鸡21~42日龄的平均日增重显著提高,料肉比和死淘率均显著降低。DIAZ-VARGAS 等[10]发现,在肉鸡基础饲粮中添加10%的发酵豆渣,显著提高了肉鸡1~21 日龄的料肉比,且对肉鸡42日龄的全净膛率、胸肌率、腿肌率和鸡肉品质无不利影响。MAHTO等[11]用豆渣粉替代花生粕饲喂鹌鹑时发现,采用50%替代量时效果最佳,鹌鹑7周龄的体质量和平均日增重显著提高。李思聪[12]用添加5%干豆渣和5%发酵豆渣的基础饲粮饲喂肉鸡时发现,肉鸡的平均日增重和料肉比均显著改善。发酵豆渣提高仙居鸡生长性能的原因可能是粗纤维在微生物发酵作用下分解,产生的可溶性多糖和可溶性膳食纤维等营养物质被微生物进一步利用,生成氨基酸、小分子肽等,使得发酵豆渣较豆粕具有更高的粗蛋白含量,且降低了大豆胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子的含量,直接提高了饲料中营养成分的利用率。
营养物质表观消化率和消化酶活性是反映动物对营养物质的消化和吸收能力的重要指标。温琼等[13]将酵母菌、芽孢杆菌和乳酸杆菌联用发酵育肥期文昌鸡混合饲料时发现,饲喂发酵饲料后文昌鸡十二指肠中的淀粉酶、糜蛋白酶活性显著提高。刘莹露等[14]用发酵玉米-豆粕饲粮饲喂22周龄蛋鸡时发现,到35周龄时,蛋鸡十二指肠淀粉酶、空肠食糜中的胰蛋白酶和脂肪酶活性均显著高于对照组,而50周龄时均无显著差异。本研究中,发酵豆渣的添加对十二指肠淀粉酶、十二指肠蛋白酶和糜蛋白酶活性的提高效果显著,与上述研究结果相似。原因是发酵豆渣中的微生物数量相比发酵前显著提升,微生物产生的外源性消化酶补充了内源性消化酶分泌的不足,同时使得饲料在仙居鸡体内进行二次发酵。并且仙居鸡十二指肠食糜中消化酶活性显著高于胰腺中消化酶活性也在一定程度上说明了这一点。由此可见,枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的共同作用改善了豆渣的营养品质,提高了仙居鸡体内淀粉酶和蛋白酶等消化酶的活性,也提高了仙居鸡粗蛋白和粗纤维的表观消化率。
谷丙转氨酶、总胆红素和白蛋白是反映动物肝功能水平的重要指标。谷丙转氨酶和总胆红素主要存在于肝脏中,血清中这2项指标水平过高往往反映肝脏组织受损[15-16]。白蛋白主要由肝脏合成,具有调节血液渗透压、修复组织损伤和促进组织生长等作用,动物的肝功能水平与机体蛋白质吸收、合成、代谢能力密切相关[17]。本研究中各组的谷丙转氨酶、总胆红素和白蛋白指标均处于健康水平,发酵豆渣的添加显著降低了血清中谷丙转氨酶活性和总胆红素含量,显著提高了血清中白蛋白含量,表明发酵豆渣对这3项指标有一定的改善作用。尿素是蛋白质代谢的终产物之一,其在血清中的含量可以反映机体蛋白质分解代谢的水平[18],发酵豆渣的添加显著降低了血清中尿素氮的含量,表明发酵豆渣提高了机体对蛋白质的合成和利用。赵鹏飞[19]用16%发酵豆渣替代豆粕的基础饲粮饲喂大口黑鲈56 d时发现,试验组血浆中谷丙转氨酶活性显著低于对照组。
发酵改善了豆渣的营养物质组成,产生的丰富的生物活性物质对血清抗氧化指标具有显著影响。SITANGGANG等[20]用米曲霉固态发酵豆渣发现,米曲霉产生的胞外酶,特别是蛋白质、糖类的分解酶会促进具有抗氧化活性的氨基酸、肽和异黄酮衍生物的生成,使得发酵产物的抗氧化活性显著提升,最高达5.5 倍。GUPTA 等[21]通过代谢组学检测发现,相比于未发酵前,发酵豆渣多酚类和黄酮类物质的含量显著提高,此外,检测到的异黄酮类(主要是大豆异黄酮)从糖苷形式转变为苷元形式,从而更易被动物机体吸收和利用。尹琳琳等[2]发现多菌种联用发酵后的豆渣中糖苷型大豆异黄酮含量降低了68.3%,苷元型大豆异黄酮含量提高了2.3倍。王一冰等[22]发现,在基础饲粮中添加300 mg/kg大豆异黄酮显著降低了文昌鸡血浆中丙二醛的含量。本研究中各添加量的发酵豆渣均显著提高了仙居鸡血清中的超氧化物歧化酶活性,显著降低了丙二醛含量,进而使动物机体抗氧化能力得到显著改善。关于发酵豆渣的抗氧化作用,已在育肥猪[23]、泌乳母猪[24]、水产动物[19,25]上有较多研究,但在肉鸡上仍鲜有报道。发酵微生物自身也可对动物机体的抗氧化能力产生显著影响。杨敏敏等[26]报道,肉鸡饲粮中添加枯草芽孢杆菌可显著提高血清中过氧化氢酶活性,显著降低血清中丙二醛含量,进而显著提高血清总抗氧化能力。石敏等[27]在樱桃谷鸭的基础日粮中添加5.0%新型酿酒酵母培养物,结果发现樱桃谷鸭的血清总抗氧化能力显著提高,丙二醛含量显著降低。本研究还发现,发酵豆渣的添加显著提高了仙居鸡血清中铁的浓度,血铁浓度也与机体的抗氧化能力密切相关。ADEGOKE等[28]用姜黄粉和辣椒粉作为抗氧化剂饲喂肉鸡发现,在适宜用量下肉鸡血铁浓度和红细胞的数量显著提高,血清谷丙转氨酶活性等肝功能指标也有显著改善。血清中各项指标所代表的多种机体功能间存在着紧密的联系,从结果来看,发酵豆渣对仙居鸡血清指标的整体提升效果显著,使机体的蛋白质合成吸收能力和抗氧化能力得到显著改善,进而提高了仙居鸡的生长性能。
微生物发酵饲料因促进生长、提高免疫力、改善氧化应激、维持肠道微生物稳态等优点而受到了广泛的关注[29-30],成为新时代饲料业的一个热门研究方向。在本研究中,发酵豆渣组在仙居鸡生长性能、血清指标、营养物质表观消化率和消化酶活性方面的表现总体上与抗生素组无显著差异,发酵豆渣对仙居鸡的生长发育和健康同样起到积极作用。其中,T3组在血清谷丙转氨酶活性、白蛋白含量、血尿素氮含量等指标上的提升效果优于抗生素组(与对照组相比效果更显著),T4组在料重比、血清谷丙转氨酶活性、总胆红素和血尿素氮含量、粗蛋白和粗纤维表观消化率、十二指肠淀粉酶和十二指肠蛋白酶活性等指标上的提升效果优于抗生素组。由此可得,发酵豆渣在动物机体肝功能和蛋白质消化吸收等方面的提升效果优于抗生素,可在一定程度上替代抗生素,起到促进生长、维持健康的作用。魏越波[31]用枯草芽孢杆菌和酿酒酵母发酵的玉米-豆粕饲料饲喂蛋鸡后发现,蛋鸡的生产效率显著提高,免疫因子指标和免疫器官指数有一定程度的提高,同时,肠道中有害菌丰度下降,微生物群落结构得到改善。本实验室团队[32]此前用枯草芽孢杆菌、黑曲霉和酿酒酵母发酵的豆粕-茶渣饲粮饲喂罗斯308肉鸡发现,发酵饲料与抗生素对肉鸡生长性能、免疫器官指数和抗氧化能力等指标均有显著改善作用,发酵饲料具有替代抗生素的潜质。但在大规模的实际生产中,发酵饲料能否完全替代抗生素仍需对其具体使用方法和作用机制作进一步研究。
豆渣的营养价值较高,成分丰富多样,是一种优质的饲料原料。但由于鲜豆渣的含水量高达83%~85%,储存和运输难度高,并且本身质地粗糙、适口性差、富含抗营养因子,难以直接作为饲料使用。因此,开发豆渣作为饲料资源需要对其进行精深加工,降低含水量,改善营养价值。一般饲料制作中涉及的烘干方法虽能有效降低豆渣的含水量,但其营养物质也损失较多。微生物的发酵作用既能消耗豆渣中的水分,又能消除其中的部分抗营养因子,提高营养物质含量,因此发酵豆渣在实际的畜禽生产中相比于鲜豆渣和烘干豆渣具有更高的可行性。
本研究中,以发酵豆渣等量替代4%豆粕的基础饲粮的饲喂效果最佳,具体表现为对仙居鸡的生长性能、粗蛋白和粗纤维的表观消化率、十二指肠和胰腺消化酶的活性和血清指标显著改善。过高(替代6%豆粕)和过低(替代2%豆粕)发酵豆渣添加量的饲喂效果均有所下降,可能是因为发酵豆渣虽然较豆粕营养价值有所改善,但代谢能低于豆粕,添加过多的发酵豆渣反而降低了饲料的总体能量水平。本试验中T5组的粗蛋白表观消化率优于T4组,消化酶活性和血清指标表现与T4组相当,而在生长性能方面,T4组的平均日增重和料重比表现均优于T5组,可能是因为过多微生物的发酵作用使得豆渣中的大分子营养物质被分解成较多易吸收的小分子活性物质,虽然对畜禽的消化能力和健康具有显著的改善效果,但也造成了能量水平的降低,故在实际生产中需要把控合适的添加量,最大化利用发酵豆渣对畜禽生长的促进效果。
使用发酵豆渣饲喂仙居鸡,可显著提高仙居鸡的生长性能、粗蛋白和粗纤维的表观消化率,以及十二指肠和胰腺消化酶的活性,还可显著改善仙居鸡的谷丙转氨酶、总胆红素、白蛋白、超氧化物歧化酶、丙二醛等血清指标,同时,发酵豆渣表现出一定的替代抗生素的功效。经综合分析,发酵豆渣等量替代4%豆粕的仙居鸡基础饲粮的饲喂效果最佳。