丝兰提取物与日粮精粗比对体外发酵和甲烷产生量的交互影响

■ 包乌日汉 青 春 曲永利 王鹏宇 徐 明* 齐景伟

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 014010；2.农业农村部东北平原农业绿色低碳重点实验室，黑龙江大庆 163319；3.内蒙古优然牧业有限责任公司，内蒙古呼和浩特 015200）

家畜来源的温室气体产生与排放越来越受到全球重视。通过营养调控技术实现反刍动物的低碳养殖，不仅符合我国国民经济和现代畜牧业发展的方向，也契合我国降低甲烷产生的技术需求。畜牧业碳排放结构主要包括：反刍动物排放气体39%，饲料生产26%，饲养21%，其他14%。反刍动物甲烷排放量主要受日粮组成的影响，与纤维含量密切相关。当日粮中纤维含量增加时，纤维分解菌增殖，瘤胃为乙酸型发酵，产生大量氢气，产甲烷菌增殖，甲烷产生量增加[1]。

丝兰（Yucca schidigera）是龙舌兰科丝兰属植物，主要分布于美国西南部和墨西哥北部的沙漠地区，在我国浙江、广东、广西等地有种植。丝兰提取物是将丝兰原木直接挤压出汁液，蒸发浓缩后成为丝兰提取液，或将浸渍后的丝兰原木干燥，再研磨成丝兰提取粉[2]。在饲料中加丝兰提取物时瘤胃内的原虫数量会降低，导致产甲烷菌数量下降，从而降低甲烷的产量[3-5]。丝兰提取物中的皂苷通过抑制脲酶活性，降低尿素分解速率，影响微生物对非蛋白氮物质的代谢，从而增加菌体蛋白的合成，减少氨氮排放[5]。Xu等[6]报道，丝兰提取物可在各种粗饲料种类条件下降低体外甲烷产生量。试验在此基础上，进一步研究丝兰提取物在不同日粮精粗比日粮条件下对甲烷产生量的影响规律。

1 材料与方法

1.1 添加剂

丝兰提取物从Distributors Processing Inc.（Porterville, CA, USA）获得。

1.2 试验设计

试验包含4个小试验。试验1、2、3的发酵底物分别是低精粗比日粮（精粗比为10∶90）、中精粗比日粮（精粗比为50∶50）和高精粗比日粮（精粗比为10∶90），在这些日粮中分别加入0、55、110、220、440 mg/kg 的丝兰提取物，每个处理6 个重复。试验4 的发酵底物同试验1、2、3，为低（精粗比为10∶90）、中（精粗比为50∶50）和高（精粗比为10∶90）精粗比日粮，在这些日粮中分别加入0、110 mg/kg 的丝兰提取物，研究日粮精粗比与丝兰提取物的交互作用，共6 个处理，每个处理6 个重复。瘤胃瘘管供体牛的日粮组成见表1。

表1 瘤胃瘘管供体牛的日粮组成(干物质基础)

1.3 瘤胃液

瘤胃液从2 头成年荷斯坦阉牛瘤胃获得。供体牛日粮组成为70%苜蓿干草和30%精料补充料，配方及营养成分见表1。每天供应1.75 倍维持净能需要量，在07：00 和17：00 等分为2 次饲喂。早饲2 h 后，分别从每只牛瘤胃取1 kg内容物，混合均匀，5 min之内带到实验室，厌氧搅拌，然后通过4 层纱布和玻璃棉过滤得到瘤胃液。

1.4 体外发酵

缓冲液配制参照Goering 等[7]和Van Soest 等[8]。瘤胃液（200 mL）和缓冲液（1 100 mL）在二氧化碳环境下混合加热到39 ℃，制成发酵液。

发 酵 装 置 选 用Ankom Technology（Macedon，NY，USA）生产的持续压力记录装置。发酵瓶容积为260 mL，每个瓶内加入0.6 g 饲料样品。把50 mL发酵液加入到发酵瓶中，通入二氧化碳，在39 ℃下发酵24 h。

1.5 样品的采集和分析

发酵瓶中压力每5 min自动记录一次。发酵24 h后，冷却发酵瓶，取气体样品，用气相色谱仪分析甲烷含量。测定发酵液pH，取1.5 mL液体，加入0.3 mL偏磷酸溶液（250 g/L），39 000 r/min 离心15 min，用气相色谱仪分析挥发性脂肪酸（VFA）含量。

压力数据用如下模型（Blümmel等[9]）模拟：

式中：P——压力（Pa）；

k——气体产生速率（/h）；

t——时间（h）；

l——延迟时间（h）。

1.6 统计分析

数 据 用GraphPad Prism 5（GraphPad Software,Inc., La Jolla, CA, USA）分析，得出参数。然后用标准大气压（101.325 kPa）校正实际大气压（96.538 kPa）。

试验1、2、3 数据按单因素完全随机试验设计进行分析，选用SPSS 13.0 的GLM 模型，然后用Regression模型分析线性和二次显著度。试验4数据按两因素试验设计进行分析，包含日粮精粗比与丝兰提取物的交互作用，选用SPSS 13.0 的GLM 模型。显著度选用P<0.05，多重比较选用Duncan’s法。

2 结果与分析

2.1 丝兰提取物对低精粗比日粮体外发酵和甲烷产生量的影响

由表2 可知，丝兰提取物对甲烷产生率的影响呈剂量依赖性，先降低后升高，110 mg/kg 丝兰提取物对甲烷的抑制效果最好（P<0.05）。过量的丝兰提取物（440 mg/kg）会降低气体产生量、提高延迟时间、降低24 h 的压力和产气量（P<0.05）；最大压力和最大产气量表明，过量的丝兰提取物对发酵产生负面影响（P<0.05）。丝兰提取物不影响发酵液pH、降解速率和VFA的组成及产量（P>0.05）。

表2 丝兰提取物对高精料日粮体外发酵和产气的影响

2.2 丝兰提取物对中精粗比日粮体外发酵和甲烷产生量的影响

由表3 可知，丝兰提取物对甲烷产生量的影响呈剂量依赖性，先降低后升高，55～440 mg/kg 丝兰提取物对甲烷均有抑制效果。过量的丝兰提取物（440 mg/kg）会显著降低24 h 产气量和最大产气量（P<0.05）。说明过量的丝兰提取物对发酵产生负面影响。丝兰提取物不影响发酵液pH、VFA 的组成（除异丁酸外）及产量（P>0.05）。

表3 丝兰提取物对中等精料日粮体外发酵和产气的影响

2.3 丝兰提取物对精粗比日粮体外发酵和甲烷产生量的影响

由表4 可知，丝兰提取物对甲烷产生量的影响呈剂量依赖性，先降低后升高，110 mg/kg 丝兰提取物对甲烷均有显著的抑制效果（P<0.05）。丝兰提取物对24 h 压力和产气量及延长时间的影响呈剂量依赖性，先降低后升高。过量的丝兰提取物（440 mg/kg）会降低气体产生量（P<0.05）。除戊酸和乙酸外，丝兰提取物不影响发酵液pH 和VFA 的组成及产量（P>0.05）。

表4 丝兰提取物对低精料日粮体外发酵和产气的影响

2.4 丝兰提取物与日粮精粗比对体外发酵和甲烷产生量的交互影响

由表5可知，110 mg/kg丝兰提取物对甲烷有显著的抑制作用（P<0.05）。不同精粗比对发酵液pH、24 h的压力和24 h产气量、最大压力、最大产气量、降解速率、延长时间和VFA 有显著影响（P<0.05）。丝兰提取物与日粮精粗比对甲烷均有显著的抑制作用（P<0.05），二者之间没有交互作用（P>0.10）。

表5 丝兰提取物与日粮精粗比类型对体外产气和发酵的影响

3 讨论

3.1 丝兰提取物对瘤胃发酵和甲烷产生量的影响

丝兰提取物中的皂苷通过抑制脲酶活性，降低尿素分解速率，影响微生物对非蛋白氮物质的代谢，从而增加菌体蛋白的合成，可以减少甲烷排放[10]。Ridla等[11]报道，皂苷可减少反刍动物体内肠道甲烷的排放，并提高营养物质的消化率，但是添加水平不能超过0.5%。在适当的剂量下，皂苷可以抑制原生动物的数量[12]。研究表明，丝兰皂苷能有效抑制瘤胃甲烷和氨气产量[13-14]。添加5.0 g/kg 的丝兰植物粉末可降低体外发酵甲烷产量和氨氮含量,但对饲粮瘤胃降解有抑制作用[15-17]。丝兰可以减少甲烷排放，降低N2O及尿氮和粪氮的排放量。

Goodall 等[18]报道,日粮中添加丝兰皂苷能显著增加丙酸的比例,不影响总挥发性脂肪酸。冯志华[19]研究皂苷对奶牛瘤胃发酵、甲烷产量、营养物质消化代谢及其抗氧化能力和免疫功能的影响，结果显示，添加皂苷对pH 和VFA 浓度无显著影响；随着皂苷添加水平的升高，甲烷排放量线性降低。Lila等[20]在不同培养底物添加不同浓度的丝兰皂苷（1.2、1.8、2.4、3.2 g/L）进行体外试验,结果表明,甲烷产量随着丝兰皂苷剂量增加而线性降低。本试验中丝兰提取物的添加对pH 和VFA 浓度无显著影响，随着添加水平的升高，体外甲烷排放量呈线性降低。Pen 等[21]研究发现，丝兰皂苷使总挥发性脂肪酸浓度下降，Lovett 等[22]也得到相同结果。丝兰皂苷对瘤胃VFA 的影响,目前没有统一的结果，可能是由于体内体外试验差异造成的；或者可能与丝兰皂苷添加量及日粮精粗比有关系[23]。宋坤烊[24]研究不同添加水平的6 种植物提取物对肉羊瘤胃发酵特性、甲烷产量和总产气量的影响，结果显示，与对照组相比，丝兰皂苷组的pH 和总产气量差异不显著，与本试验结果一致。

3.2 精粗比对瘤胃发酵和甲烷产生量的影响

影响反刍动物瘤胃发酵的因素有饲料营养成分、饲料加工贮存和日粮精粗比等。日粮在瘤胃中的发酵程度主要取决于能迅速水解的碳水化合物的数量，特别是糖和淀粉的含量[25]。因此改变日粮中的精粗比，会使纤维性和非纤维性碳水化合物的比例发生变化，从而显著地影响瘤胃发酵[26]。

VFA 是日粮中的碳水化合物在瘤胃内发酵的终产物,也是反刍动物维持生命活动及生产所需能量的主要来源[27]。多项研究表明，日粮精粗比例不同，乙酸、丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸的产量不同，从而影响瘤胃甲烷产量[28-30]。Mc Allan 等[31]的试验表明，奶牛高精料水平日粮会显著降低瘤胃pH 和乙酸浓度，增加丙酸浓度，但不影响总VFA 浓度。Merchen 等[32]用高粗料和高精料日粮饲喂羯羊进行对比试验，结果表明瘤胃内TVFA 浓度不受影响；喂高精料日粮时乙酸和丁酸的浓度显著降低，丙酸浓度显著升高。这些结果与本试验结果一致。

随精料比例增加,pH 显著降低，总TVFA 不受影响或略有降低[26，33-34]。据报道，对日本黑牛育肥阶段进行研究，结果表明，增加精料比例会导致瘤胃pH降低。本试验中，发酵底物为高精粗比组与中精粗比组和低精粗比组相比，发酵pH 降低，这跟前人的研究结果一致。由于日粮中精料比例增加会影响反刍动物日粮纤维比例，使日粮中纤维比例下降，缩短咀嚼和反刍时间，使反刍动物采食时口腔唾液分泌量减少，导致进入瘤胃的唾液含量减少，缓冲pH 的能力降低，瘤胃pH 进一步降低。提高日粮精料比例可以显著降低瘤胃pH，主要是由淀粉摄入量增加导致的[37]。

3.3 丝兰提取物与精粗比对甲烷产生率的交互影响

适当增加日粮精粗比能够显著降低反刍动物甲烷排放量[38-40]。王洪荣等[41]在不同精粗比日粮中添加0.3%茶皂素和0.03%丝兰皂苷的混合物，研究不同精粗比以及皂苷条件下对瘤胃发酵和瘤胃微生物的影响。结果显示，茶皂苷和丝兰皂苷的混合物能降低瘤胃pH，并且精粗比为20∶80 时差异极显著[41]。

Erydvuz 等[42]研究发现，偏精料日粮条件下，丝兰提取物对纤维分解菌没有抑制作用，因此对甲烷产量没有显著抑制作用；然而在以采食草或者草-豆科为主的绵羊日粮中添加丝兰提取物可以降低甲烷的产量。李国祥等[43]研究表明，在偏精型日粮条件下，添加10 mg/g 丝兰提取物对瘤胃发酵参数及甲烷产量、抑制原虫活性及抑制甲烷菌效果最佳。本试验结果显示，110 mg/kg 丝兰提取物对甲烷均有显著的抑制效果。陈旭伟[26]研究发现，体外48 h 累计产气量时皂苷与精粗比之间存在交互作用。本研究结果显示，丝兰提取物与精粗比间无交互作用。丝兰提取物在不同精粗比日粮下，对甲烷产生的抑制效果存在差异，精料比例高时甲烷产量会升高，同时抑制剂对甲烷产生的抑制效果会更明显；而丝兰提取物的最适添加量也因日粮精粗比例不同而显出差异[43]。本研究假设，精粗比影响最适丝兰提取物添加量。而结果显示，无论是粗饲料发酵底物，还是中等精料、高精料发酵底物，丝兰提取物对甲烷产生率的影响均呈先降低后升高的趋势，110 mg/kg 丝兰提取物对甲烷的抑制效果最好。以前的研究显示，丝兰提取物主要通过改变瘤胃微生物区系，进而影响甲烷产生率[3，44]。丝兰提取物不是通过直接接收或影响氢产量的方式降低甲烷产生率，这是二者之间无交互作用的原因。

4 结论

在低、中和高精粗比日粮为发酵底物条件下，丝兰提取物对体外甲烷产生量均有显著抑制作用，呈剂量依赖性关系，最佳剂量均为110 mg/kg。