槐定碱肟醚衍生物的合成、抗菌活性及分子对接研究

魏世洋, 李金坪, 伍亚晴, 李清文, 王立升

(1.广西大学化学化工学院, 广西南宁530004;2.浙江京新药业股份有限公司, 浙江新昌312500;3.广西大学医学院, 广西南宁530004)

0 引言

随着抗生素的滥用,耐药性的问题给医疗领域带来了巨大的危害,增加了患者的二次感染概率同时容易感染其他疾病[1-3],已成为全球医疗工作者面对的巨大挑战,因此,寻找新结构类型的抗菌药物应对不断变化的细菌感染疾病具有重要意义。

槐定碱是从苦参、山豆子等植物中提取的一种天然四环喹啉生物碱,分子式为C15H24N2O,相对分子质量为248.36,白色粗针状结晶。槐定碱不仅拥有良好溶解性和生物安全性的特性,还具有广泛的生物活性如抗菌[4]、抗肿瘤[5-6]、抗炎[7]和杀虫[8]等活性,因此,常作为药物的先导化合物。一方面,由于槐定碱特殊的内酰胺结构,14位C上的H位于羰基α位,性质活泼,能在强碱条件下形成碳负离子,发生取代反应和亲核取代-消去反应[9-11];另一方面,肟醚具有良好的抗肿瘤[12]、抗菌[13]和杀虫[14]等生物活性,因此,科研人员常将基团引入到其他化学结构中,从而达到增强抗菌活性的目的。Ramalingan等[15]合成了一系列取代哌啶-4-酮肟醚,并测试了其抗菌活性,抗菌实验结果表明,当苄基单元的苯环上引入了吸电子基,可以使化合物的抗菌活性提高。李倩等[16]设计合成了一系列新型含肟醚结构的丁烯内酯类化合物,并测试了这些化合物的体内抗菌活性,实验结果表明,当苄基的苯环上存在卤素取代和硝基等吸电子基取代时,抗菌活性要强于给电子基甲氧基取代的化合物。

1 实验

1.1 试剂与仪器

核磁共振仪(AVANCE Ⅲ HD600型,德国Bruker公司);超高效液相-质谱联用仪(ImpactⅡ型,德国Bruker公司);酶标仪(Infinite E Plex型,帝肯奥地利有限公司)。槐定碱 (纯度为98%,陕西昂盛生物科技有限公司);亚硝酸叔丁酯、双(三甲基硅基)氨基钠(NaHMDS)、氢化钠(NaH)、溴苄及溴苄取代物均在上海安耐吉化学有限公司购买;所有试剂均为分析纯或化学纯。氟康唑(批号： 93MNRN8R)-白色假丝酵母;硫酸卡那霉素(批号： 9VEX2REK)-大肠杆菌;青霉素G钠(批号： 97YRRM7D)-金黄色葡萄球菌;头孢他啶(批号： 9DDADRLX)-铜绿假单胞菌#5336;盐酸多西环素(批号： EH0RRQ4R)-痤疮丙酸杆菌;以上标准品均购于上海安耐吉化学有限公司。

1.2 目标产物的合成

1.2.1 中间产物A的合成

称取槐定碱10 g加入三颈烧瓶中,氮气保护下分别加入无水四氢呋喃20 mL和双(三甲基硅基)氨基钠70 mL,常温搅拌30 min。在冰浴条件下缓慢加入亚硝酸叔丁酯30 mL,加料完毕,在常温下搅拌4～5 h。薄层色谱法(TLC)检测产物,反应完毕后浓缩除去溶剂,反应体系用乙酸乙酯和水进行萃取,合并有机相,干燥,浓缩,将粗产物经硅胶柱层分析分离提纯,使用乙酸乙酯与石油醚的体积比为3∶1的混合液洗脱,得到淡黄色固体A6.73 g,收率为68%,熔点为96 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 15.30 (s, 1H), 3.52 (dd,J=14.0, 4.7 Hz, 1H), 3.50～3.46 (m, 1H), 3.19 (dd,J=14.0, 11.6 Hz, 1H), 2.89 (ddt,J=11.9, 4.0, 1.9 Hz, 1H), 2.81～2.76 (m, 1H), 2.70 (ddd,J=15.6, 7.0, 3.7 Hz, 1H), 2.50 (ddd,J=15.4, 11.2, 3.9 Hz, 1H), 2.24 (ddt,J=13.9, 7.0, 4.2 Hz, 1H), 2.21～2.09 (m, 2H), 2.02 ～1.90 (m, 3H), 1.89～1.82 (m, 2H), 1.75～1.61 (m, 3H), 1.53 (dd,J=7.5, 2.3 Hz, 3H), 1.10 (tdd,J=12.8, 10.8, 4.4 Hz, 1H).13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 161.65, 142.17, 63.30, 55.94, 55.39, 50.63, 46.80, 39.83, 31.69, 29.76, 26.44, 26.39, 23.97, 21.47, 21.33。 HR-MS (ESI )： C15H23N3O2计算的质荷比为278.179, 测试质荷比为278.189[M + H]+。

1.2.2 目标化合物B1,B2,…,B12的合成

称取A(0.01mol)2.78 g加入100 mL双颈烧瓶中,加入氢化钠,氮气保护下加入无水四氢呋喃20 mL和溴苄(0.011 mol)1.88 g,反应4～6 h。TLC检测产物,反应完毕后浓缩除去溶剂,调节pH为中性,用二氯甲烷和水进行萃取,合并有机相,干燥,浓缩,将粗产物经硅胶柱层析分离提纯,使用二氯甲烷与甲醇的体积比为50∶1的混合溶剂洗脱分离纯化得到目标化合物B1,B2,…,B12。槐定碱肟醚合成路线如图1所示。

图1 槐定碱肟醚合成路线Fig.1 Synthesis of sophoridine oxime ether

B1：14-(3,5-二甲氧基苄基)肟醚基槐定碱,淡黄色固体,收率为65%,熔点为106.3～106.5 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 6.54 (d,J=2.3 Hz, 2H), 6.42 (t,J=2.3 Hz, 1H), 5.27 (d, 2H), 4.46 (dd,J=12.8, 4.5 Hz, 1H), 4.01～3.95 (m, 1H), 3.80 (s, 6H), 3.21 (t,J=12.7 Hz, 1H), 2.91 (ddd,J=17.0, 8.1, 4.6 Hz, 1H), 2.83 (ddt,J=28.6, 11.2, 2.4 Hz, 2H), 2.51 (ddd,J=17.0, 9.8, 4.8 Hz, 1H), 2.19～2.10 (m, 2H), 1.98 (qd,J=12.5, 2.8 Hz, 2H), 1.86 (dt,J=13.7, 2.3 Hz, 1H), 1.81～1.77 (m, 1H), 1.77～1.69 (m, 2H), 1.65 (dddd,J=13.8, 11.6, 6.8, 3.2 Hz, 2H), 1.59～1.52 (m, 2H), 1.49～1.42 (m, 3H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 160.79, 159.55, 149.93, 139.16, 106.17, 100.06, 63.52, 57.17, 55.37, 52.62, 42.83, 41.90, 35.58, 27.62, 26.51, 23.09, 21.09, 20.71。 HR-MS (ESI )： C24H33N3O4计算的质荷比为 428.247;测试质荷比为428.243[M + H]+。

B2：14-(对叔丁基苄基)肟醚基槐定碱,淡黄色固体,收率为62%,熔点为124.3～124.6 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 7.39 (d,J=8.3 Hz, 2H), 7.34 (d,J=8.3 Hz, 2H), 5.31 (d,J=3.6 Hz, 2H), 4.46 (dd,J=12.8, 4.5 Hz, 1H), 3.97 (ddd,J=11.6, 7.3, 4.9 Hz, 1H), 3.21 (t,J=12.7 Hz, 1H), 2.89 (ddd,J=17.1, 8.2, 4.7 Hz, 1H), 2.86～2.78 (m, 2H), 2.50 (ddd,J=17.0, 9.7, 4.8 Hz, 1H), 2.13 (dt,J=13.7, 6.1 Hz, 2H), 1.98 (qd,J=12.1, 2.8 Hz, 2H), 1.86 (dt,J=13.7, 2.3 Hz, 1H), 1.82～1.77 (m, 1H), 1.76～1.70 (m, 2H), 1.64 (dddd,J=14.2, 9.7, 4.8, 2.4 Hz, 2H), 1.59～1.52 (m, 3H), 1.50～1.42 (m, 1H), 1.33 (s,9H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.62, 151.07, 149.68, 133.81, 128.33, 125.34, 77.32, 63.53, 57.20, 57.18, 52.61, 42.82, 41.88, 35.59, 34.58, 31.34, 27.64, 26.52, 23.07, 21.11, 20.76, 20.67。HR-MS (ESI )： C26H37N3O2计算的质荷比为424.289;测试的质荷比为： 424.292[M + H]+。

近年来，随着“精益”被国内医疗机构逐渐认知，如何快速习得一套便实可用的精益医疗管理体系，为医院精益管理的院内实践落地作战略指导，并引领管理不断推进，是每位精益学习院长期待的。

B3：14-(2-溴-5-甲氧基苄基)肟醚基槐定碱,白色固体,收率为59%,熔点为131.2～131.4 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 7.41 (d,J=8.7 Hz, 1H), 6.94 (d,J=3.1 Hz, 1H), 6.70 (dd,J=8.7, 3.1 Hz, 1H), 5.35 (s, 2H), 3.77 (s, 3H), 3.63 (dd,J=13.8, 4.9 Hz, 1H), 3.54～3.41 (m, 1H), 3.25 (dd,J=13.8, 12.0 Hz, 1H), 3.01 (ddd,J=17.6, 6.3, 4.6 Hz, 1H), 2.85 (ddt,J=12.0, 3.9, 1.8 Hz, 1H), 2.76 (ddd,J=11.8, 8.5, 3.6 Hz, 1H), 2.49 (ddd,J=17.5, 11.2, 4.9 Hz, 1H), 2.18～2.06 (m, 3H), 1.96 (dd,J=10.8, 9.0 Hz, 1H), 1.92～1.78 (m, 4H), 1.66 (ddt,J=12.8, 8.6, 4.1 Hz, 1H), 1.59 (ddd,J=15.3, 5.3, 3.6 Hz, 1H), 1.56～1.47 (m, 4H), 1.13～1.03 (m, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.70, 158.88, 150.14, 137.31, 133.20, 115.72, 114.73, 113.35, 76.62, 63.45, 56.04, 55.48, 54.97, 50.74, 47.60, 39.66, 32.38, 29.78, 25.16, 24.03, 21.61, 21.47, 21.41。HR-MS (ESI )： C24H34BrN3O3计算的质荷比为 476.147;测试质荷比为 476.141[M + H]+。

B4：14-(对硝基苄基)肟醚基槐定碱,淡黄色固体,收率为70%,熔点为113.9～114.1 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 8.21 (d,J=8.7 Hz, 2H), 7.52 (d,J=8.6 Hz, 2H), 5.42 (s, 2H), 3.65 (dd,J=13.9, 4.9 Hz, 1H), 3.51 (ddd,J=10.4, 8.3, 4.1 Hz, 1H), 3.26 (dd,J=13.9, 12.0 Hz, 1H), 3.01 (ddd,J=17.6, 6.3, 4.6 Hz, 1H), 2.88 (ddt,J=12.0, 4.0, 1.8 Hz, 1H), 2.79 (ddd,J=12.1, 8.6, 3.7 Hz, 1H), 2.50 (ddd,J=17.6, 11.2, 4.9 Hz, 1H), 2.20～2.13 (m, 2H), 2.11 (dd,J=12.1, 3.2 Hz, 1H), 2.00 ～1.96 (m, 1H), 1.93 ～1.81 (m, 4H), 1.73～1.65 (m, 1H), 1.64～1.57 (m, 2H), 1.55～1.51 (m, 3H), 1.10 (tdd,J=12.8, 11.3, 4.4 Hz, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.49, 150.52, 147.59, 144.56, 128.41, 123.67, 75.77, 63.43, 56.06, 54.98, 50.76, 47.63, 39.68, 32.40, 29.79, 25.12, 24.03, 21.66, 21.51, 21.43。HR-MS (ESI )： C22H28N4O4计算的质荷比为 413.211;测试质荷比为 413.221[M + H]+。

B5：14-(邻硝基苄基)肟醚基槐定碱,白色固体,收率为72%,熔点为121～121.3 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ：8.05 (dd, J=8.2, 1.3 Hz, 1H), 7.61 (td,J=7.6, 1.3 Hz, 1H), 7.55 (dd,J=7.8, 1.4 Hz, 1H), 7.48 ～7.42 (m, 1H), 5.73 (s, 2H), 3.63 (dd,J=13.8, 4.9 Hz, 1H), 3.50 (ddd,J=10.4, 8.3, 4.1 Hz, 1H), 3.25 (dd,J=13.9, 12.0 Hz, 1H), 3.04 (ddd,J=17.6, 6.3, 4.6 Hz, 1H), 2.87 (ddt,J=12.0, 4.0, 1.8 Hz, 1H), 2.78 (td,J=8.4, 4.2 Hz, 1H), 2.53 (ddd,J=17.6, 11.2, 4.9 Hz, 1H), 2.20 ～2.13 (m, 2H), 2.10 (dd,J=12.2, 3.2 Hz, 1H), 2.00 ～1.96 (m, 1H), 1.93 ～1.85 (m, 3H), 1.84 ～1.80 (m, 1H), 1.73 ～1.64 (m, 1H), 1.63 ～1.57 (m, 2H), 1.53 (dd,J=8.8, 6.2 Hz, 3H), 1.09 (tdd,J=12.8, 11.3, 4.3 Hz, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ：159.47, 150.74, 147.52, 133.95, 133.53, 129.05, 128.36, 124.76, 73.81, 63.45, 56.06, 54.98, 50.77, 47.60, 39.67, 32.42, 29.78, 25.14, 24.05, 21.65, 21.51, 21.43。HR-MS (ESI )： C22H28N4O4计算的质荷比为 413.211;测试质荷比为 413.221[M + H]+。

B6：14-(间硝基苄基)肟醚基槐定碱,灰白色固体,收率为63%,熔点为94.5～94.7 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 8.21 (d,J=1.9 Hz, 1H), 8.17 (dt,J=8.2, 1.5 Hz, 1H), 7.70 (dt,J=7.6, 1.4 Hz, 1H), 7.54 (t,J=7.9 Hz, 1H), 5.42 (s, 2H), 3.65 (dd,J=13.9, 4.9 Hz, 1H), 3.51 (ddd,J=10.5, 8.4, 4.1 Hz, 1H), 3.27 (dd,J=13.8, 12.0 Hz, 1H), 3.03 (ddd,J=17.5, 6.3, 4.6 Hz, 1H), 2.88 (ddt,J=11.9, 4.0, 1.8 Hz, 1H), 2.79 (ddd,J=11.9, 8.6, 3.7 Hz, 1H), 2.51 (ddd,J=17.6, 11.2, 4.9 Hz, 1H), 2.21～2.09 (m, 3H), 1.99 (dd,J=10.7, 9.0 Hz, 1H), 1.94～1.81 (m, 5H), 1.73～1.65 (m, 1H), 1.65～1.50 (m, 4H), 1.15～1.06 (m, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.53, 150.57, 148.34, 139.32, 133.96, 129.44, 122.95, 122.74, 75.74, 63.47, 56.06, 54.98, 50.77, 47.65, 39.69, 32.41, 29.79, 25.12, 24.06, 21.62, 21.53, 21.41。HR-MS (ESI )： C22H28N4O4计算的质荷比为 413.211; 测试质荷比为 413.221[M + H]+。

B7：14-(2,5-二氯苄基)肟醚基槐定碱,黄色油状液体,收率为58%。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 7.37 (d,J=2.5 Hz, 1H), 7.29 (d,J=5.0 Hz, 1H), 7.22 (dd,J=8.5, 2.5 Hz, 1H), 5.41 (s, 2H), 3.67 (dd,J=13.9, 4.9 Hz, 1H), 3.55 ～3.50 (m, 1H), 3.28 (dd,J=13.8, 12.0 Hz, 1H), 3.05 (ddd,J=17.6, 6.3, 4.6 Hz, 1H), 2.89 (ddt,J=11.9, 4.0, 1.8 Hz, 1H), 2.79 (td,J=8.5, 4.3 Hz, 1H), 2.53 (ddd,J=17.5, 11.2, 4.9 Hz, 1H), 2.22～2.10 (m, 3H), 2.00 (dd,J=10.7, 9.1 Hz, 1H), 1.94～1.82 (m, 4H), 1.75～1.66 (m, 1H), 1.65～1.51 (m, 5H), 1.16～1.07 (m, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.61, 150.50, 136.69, 132.67, 131.26, 130.47, 129.14, 128.99, 73.85, 63.48, 56.08, 54.98, 50.78, 47.63, 39.69, 32.43, 29.77, 25.14, 24.05, 21.62, 21.51, 21.39。HR-MS (ESI )： C22H27Cl2N3O2计算的质荷比为436.148;测试质荷比为 436.150[M + H]+。

B8：14-(2,6-二氯苄基)肟醚基槐定碱,淡黄色油状液体,收率为70%。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 7.35 (d,J=8.1 Hz, 2H), 7.24 (dd,J=8.5, 7.6 Hz, 1H), 3.67 (dd,J=13.8, 4.9 Hz, 1H), 3.48 (ddd,J=10.3, 8.3, 4.1 Hz, 1H), 3.30 (dd,J=13.8, 11.9 Hz, 1H), 2.97～2.86 (m, 2H), 2.79 (td,J=9.0, 4.6 Hz, 1H), 2.43 (ddd,J=17.6, 11.1, 5.0 Hz, 1H), 2.11 (dt,J=13.9, 4.0 Hz, 2H), 1.99 (dd,J=10.7, 9.1 Hz, 1H), 1.88 (ddt,J=23.8, 13.3, 4.0 Hz, 3H), 1.78～1.66 (m, 2H), 1.66～1.59 (m, 1H), 1.58～1.47 (m, 3H), 1.13 (s, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.81, 150.00, 137.38, 131.77, 130.36, 128.36, 71.76, 63.53, 56.08, 54.99, 50.78, 47.63, 39.68, 32.42, 29.82, 25.13, 24.08, 21.62, 21.44, 21.22。HR-MS (ESI )： C22H27Cl2N3O2计算的质荷比为436.148;测试质荷比为 436.159[M + H]+。

B9：14-(2-甲基萘基)肟醚基槐定碱,白色固体,收率为63%,熔点为112.3～112.5 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 8.11～8.07 (m, 1H), 7.90～7.84 (m, 2H), 7.57～7.50 (m, 3H), 7.46 (dd,J=8.2, 7.0 Hz, 1H), 5.80 (d,J=1.3 Hz, 2H), 3.67 (dd,J=13.8, 4.9 Hz, 1H), 3.46 (ddd,J=10.4, 8.3, 4.1 Hz, 1H), 3.30 (dd,J=13.8, 11.9 Hz, 1H), 2.93 (ddd,J=17.6, 6.4, 4.6 Hz, 1H), 2.88 (ddd,J=11.9, 4.1, 2.0 Hz, 1H), 2.78 (ddd,J=11.7, 8.7, 3.2 Hz, 1H), 2.43 (ddd,J=17.6, 11.2, 5.0 Hz, 1H), 2.19～2.05 (m, 4H), 1.99～1.96 (m, 1H), 1.94～1.81 (m, 4H), 1.74～1.65 (m, 1H), 1.64～1.58 (m, 1H), 1.51 (ddt,J=12.7, 10.4, 4.7 Hz, 4H), 1.11 (tdd,J=12.8, 11.2, 4.3 Hz, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.93, 149.77, 133.70, 132.29, 131.96, 129.19, 128.56, 127.54, 126.35, 125.81, 125.31, 124.13, 76.07, 63.50, 56.08, 54.98, 50.77, 47.64, 39.66, 32.41, 29.83, 25.12, 24.07, 21.62, 21.44, 21.38。HR-MS (ESI )： C26H31N3O2计算的质荷比为418.242, 测试质荷比为418.251[M + H]+。

B10：14-(对氰基苄基)肟醚基槐定碱,白色固体,收率为70%,熔点为103.5～103.7 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 7.65 (d,J=8.2 Hz, 2H), 7.46 (d,J=8.1 Hz, 2H), 5.38 (s, 2H), 3.65 (dd,J=13.8, 4.9 Hz, 1H), 3.50 (ddd,J=10.4, 8.3, 4.1 Hz, 1H), 3.27 (dd,J=13.8, 12.0 Hz, 1H), 3.00 (ddd,J=17.6, 6.3, 4.6 Hz, 1H), 2.88 (ddd,J=12.0, 4.1, 2.0 Hz, 1H), 2.79 (ddd,J=12.2, 8.8, 3.7 Hz, 1H), 2.49 (ddd,J=17.5, 11.2, 4.9 Hz, 1H), 2.19～2.09 (m, 3H), 1.99 (dd,J=10.7, 9.0 Hz, 1H), 1.95～1.80 (m, 5H), 1.68 (ddt,J=12.7, 8.6, 4.1 Hz, 1H), 1.64～1.59 (m, 1H), 1.59～1.49 (m, 3H), 1.10 (tdd,J=12.8, 11.3, 4.3 Hz, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.52, 150.39, 142.53, 132.26, 128.37, 118.73, 111.74, 76.09, 63.44, 56.06, 54.98, 50.76, 47.62, 39.68, 32.40, 29.80, 25.12, 24.04, 21.67, 21.49, 21.45。HR-MS (ESI )： C23H28N4O2计算的质荷比为393.211;测试质荷比为 393.232[M + H]+。

B11：14-(2-氰基苄基)肟醚基槐定碱,白色固体,收率为72%,熔点为107.4～107.7 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 7.66 (d,J=7.6 Hz, 1H), 7.57 (d,J=7.5 Hz, 1H), 7.53 (d,J=7.7 Hz, 1H), 7.43 ～7.38 (m, 1H), 5.49 (s, 2H), 3.62 (dd,J=13.9, 4.9 Hz, 1H), 3.47 (ddd,J=10.4, 8.4, 4.1 Hz, 1H), 3.24 (dd,J=13.9, 12.0 Hz, 1H), 3.03 (ddd,J=17.6, 6.3, 4.5 Hz, 1H), 2.86 (ddd,J=11.6, 4.1, 2.0 Hz, 1H), 2.76 (ddd,J=11.9, 8.7, 3.5 Hz, 1H), 2.50 (ddd,J=17.0, 11.2, 4.9 Hz, 1H), 2.18～2.07 (m, 3H), 1.96 (dd,J=10.7, 9.0 Hz, 1H), 1.92～1.78 (m, 4H), 1.72～1.62 (m, 1H), 1.62～1.47 (m, 4H), 1.13～1.02 (m, 1H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.55, 150.76, 140.57, 133.12, 132.85, 129.59, 128.55, 117.27, 111.95, 74.70, 63.46, 56.04, 54.98, 50.76, 47.62, 39.66, 32.37, 29.78, 25.12, 24.05, 21.59, 21.42, 21.40。HR-MS (ESI )： C23H28N4O2计算的质荷比为393.211;测试质荷比为 393.232[M + H]+。

B12：14-(3-硝基-4氟-苄基)肟醚基槐定碱,白色固体,收率为63%,熔点为117.9～118.1 ℃。1H NMR (600 MHz, CDCl3),δ： 8.06 (dd,J=7.1, 2.2 Hz, 1H), 7.66 (ddd,J=8.5, 4.2, 2.2 Hz, 1H), 7.34～7.26 (m, 1H), 5.35 (s, 2H), 4.44 (dd,J=12.8, 4.5 Hz, 1H), 3.23 (t,J=12.7 Hz, 1H), 2.92 (ddd,J=17.0, 8.0, 4.6 Hz, 1H), 2.83 (ddt,J=29.4, 11.4, 2.3 Hz, 2H), 2.52 (ddd,J=16.9, 9.9, 4.8 Hz, 1H), 2.24～2.12 (m, 2H), 2.05～1.94 (m, 2H), 1.90～1.86 (m, 1H), 1.77～1.62 (m, 5H), 1.56 (ddd,J=13.6, 6.9, 3.7 Hz, 2H), 1.49～1.44 (m, 3H)。13C NMR (151 MHz, CDCl3),δ： 159.11, 156.00, 154.24, 151.02, 135.20, 125.58, 118.51, 75.00, 63.43, 57.16, 52.63, 42.87, 41.94, 35.57, 27.61, 26.50, 23.04, 21.08, 20.79, 20.73。HR-MS (ESI )： C23H27FN4O4计算的质荷比为430.202;测试质荷比为431.198[M + H]+。

1.3 目标化合物的抑菌活性测试

首先根据标准方法分别配置各受试细菌的培养基(肉汤)以及各受试细菌,然后称取待测化合物32 mg完全溶解于二甲基亚砜10 μL,并用肉汤990 μL将其稀释。抗菌实验采用二倍稀释法测试目标化合物抑菌活性。每孔预先加入肉汤100 μL,用微量移液枪吸取已配制样品液100 μL加入酶标板孔1中,用移液枪吹打3次后吸取孔1的样品液100 μL加入孔2中。重复操作至孔8后,从孔8中吸取100 μL弃去,最终样品液质量浓度分别为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL,同时设置3个平行组。除空白对照外其余每孔中加入菌液5 μL,然后把96孔板放置培养箱中待培养到对数期,用酶标仪测其波长为600 nm的吸光度OD600,平行孔中的OD600值之差在标准误差范围内,说明所得数值可信,依据所得数据再设定适宜的浓度梯度筛出各待测化合物的最小抑菌浓度(mininal inhibit concentration, MIC),头孢他啶、青霉素、硫酸卡那霉素、氟康唑、多西环素分别作为铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色假丝酵母和痤疮丙酸杆菌的抑菌实验中的阳性对照药,肉汤作为阴性对照。

1.4 分子对接

首先根据体外抗菌实验的菌种选择相应的蛋白,通过网站RCSB PDB数据库选择受体蛋白[17],筛选出受体蛋白(PDB ID：6GVB)。Reichenbach等[18]的研究结果表明,痤疮丙酸杆菌相关蛋白(PDB ID：6GVB)是一种功能性二聚外显β-1,4-甘露糖苷酶,它能够催化经典真核N-聚糖核心中第2个GlcNAc和第1个甘露糖残基之间的β-1,4-糖苷键的水解。在对接软件Discovery studio导入合成的槐定碱衍生物3D结构与受体蛋白进行对接,当配体对接到蛋白质受体时,对接软件将小分子放在靶标蛋白的活性位点处,通过不断的优化调整配体化合物的空间位置、构象和受体氨基酸残基,在所有构象中寻找到配体化合物与受体蛋白作用的最佳构象,观察配体化合物与受体蛋白的结合方式与相互作用。

2 实验结果与讨论

2.1 合成

中间体A的制备过程,在除去溶剂阶段必须把溶剂和未反应完全的亚硝酸叔丁酯除净,否则在萃取时会导致产物收率下降,该反应条件温和,后处理容易,收率高可以达到68%。中间体A上的肟双键存在顺反异构,关键中间体A的绝对构型如图2所示。从图2中可以看到,中间体A为反式构型。

图2 中间体A的绝对构型Fig.2 Absolute configuration of intermediate A

化合物B1的1H NMR结构显示,化学位移分别为6.5、6.42的双重峰和三重峰为苯环上H,化学位移为5.27的双重峰为苄基碳上H,化学位移为3.80的单重峰为苯环上2个甲氧基上的H,化学位移为3.21的三重峰为槐定碱的特征H,同时化学位移为15.30的羟基单重峰消失。以上实验结果说明,溴苄上的溴原子被14-肟基槐定碱取代得到目标化合物。

2.2 抗菌活性

目标化合物的抗菌活性实验结果见表1。

表1 目标化合物的抗菌活性实验结果Tab.1 Experimental results of antibacterial activity of target compounds

从表1可见,大部分目标化合物对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金色葡萄球菌和白色假丝酵母的抑制效果一般,但在一定程度上提高了槐定碱母体的抗菌活性,其中化合物B4对大肠杆菌的抑制效果最好,MIC为3.127 mg/mL;化合物B5对铜绿假单胞菌、白色假丝酵母的抑制效果最好,MIC分别为4.568、6.372 mg/mL;化合物B12对金色葡萄球菌的抑制效果最好,MIC为1.337 mg/mL。大部分化合物对痤疮丙酸杆菌的抑制效果较好,其中化合物B5、B12对痤疮丙酸杆菌的抑制效果最好,MIC分别为0.023、0.014 mg/mL,优于阳性对照药物盐酸多西环素。

初步构效分析,对于痤疮丙酸杆菌,含有吸电子基团的化合物一般有优良的活性(B4、B5、B6、B7、B8、B12),而给电子的基团一般活性较差(B1、B2、B3、B9);对于大肠杆菌,当苯环对位上存在强吸电子基(B4)时,抗菌活性最好。总体来看,当苯环上有吸电子基取代时抗菌活性要强于给电子基,同时吸电子基中硝基取代体现出更强的抗菌活性,但是不同细菌对取代基的取代位置要求不同,当硝基位于对位时对大肠杆菌的抑制效果最好,而硝基位于邻位时对痤疮丙酸杆菌的抑制效果最好要强于良性对照药物。

2.3 分子对接

筛选痤疮丙酸杆菌相关蛋白(PDB ID：6GVB)与槐定碱和抑制效果优于阳性对照药的化合物B5、B12进行分子对接,进一步研究目标化合物的抑菌机制,对接结果如图3所示。槐定碱、化合物B5和B12与6GVB相互作用见表2

表2 槐定碱、化合物 B5、B12与6GVB相互作用Tab.2 Interaction of sophoridine, compounds B5 and B12 with 6GVB

(a) 2D图 (b) 分子作用图 (c) 3D图

从表2可见,槐定碱与6GVB受体蛋白的氨基酸残基并没有氢键作用和π-π共轭作用,只是有一些弱的作用力,对痤疮丙酸杆菌的抑制效果较差,与抗菌实验结果相符。从图3可见,①苯环上硝基和ASN A：139、SER A：88之间形成氢键作用;②肟上的氧原子与SER A：89之间形成氢键作用;③B5的苯环和与受体蛋白上多个氨基酸残基形成了π-π共轭作用和其他弱作用力。B12与6GVB受体蛋白分子对接如图3所示：①苯环上硝基和氟原子与TRP A：217、ASN A：139、SER A：88形成氢键作用;②肟上的氧原子与SER A：89之间形成氢键作用;③B12的苯环和与受体蛋白上多个氨基酸残基形成了π-π共轭作用和其他弱作用。

综合分析,化合物B5、B12与6GVB受体蛋白的相互作用强于槐定碱。受体蛋白与化合物B5、B12之间具有较强的作用,大大地增强了二者之间的结合力和稳定性,从而增强抑菌活性。

3 结论

本文中设计合成了12个槐定碱肟醚类衍生物,所有目标化合物经过1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS进行了结构表征,表征结果与目标化合物结构一致。对目标化合物及槐定碱测试了铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痤疮丙酸杆菌和白色假丝酵母的抑菌活性。实验结果表明槐定碱的抑菌效果并不理想,改造之后的槐定碱衍生物的抑菌活性相比于槐定碱有所提升。值得一提的是,化合物B5、B12对痤疮丙酸杆菌的抑制效果要优于阳性对照药物多西环素,MIC为0.023、0.014 mg/mL。分子对接结果表明,B5、B12与6GVB受体蛋白存在多个氢键和π-π共轭作用,增加了化合物与受体蛋白之间的结合力与稳定性。受体蛋白与小分子之间相互作用越强抑菌效果越好,与抗菌实验结果相符。该研究结果为进一步开发治疗痤疮丙酸杆菌药物提供了有益参考。