细胞外囊泡和非编码RNA对卵泡发育调控的研究进展

蒋君 王德婧

基金项目：贵州省科技厅联合基金（20177104）、贵州省中医药管理局项目（2018072）、贵州省科技厅科技成果应用与产业化项目（20194447）、贵州省卫生健康委科学技术基金项目（2022146）和遵义医科大学博士基金（201704）

摘要：细胞外囊泡（EV）是磷脂双层膜结构的纳米级囊泡，富含源自亲代细胞的生物分子如核酸、代谢产物、蛋白质和脂质类物质等，主要负责细胞间通讯及信号传递和物质运输交流，对靶细胞功能产生影响。近年来不孕症发病率逐年升高，排卵障碍在不孕因素中占比较高。非编码RNA参与卵泡发育的一系列生理和病理过程，在女性不孕症中发挥重要作用。本综述系统介绍了EV种类和生物学功能，重点探讨EV和非编码RNA对颗粒细胞功能、卵母细胞成熟、排卵和黄体形成及甾体类激素合成的影响，阐述其对卵泡发育的调控研究，为不孕症的诊治提供新思路和切入点。

关键词：细胞外囊泡；非编码RNA；生物分子；卵泡发育

中图分类号： R711.6  文献标志码： A  文章编号：1000-503X（2023）05-0821-06

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15293

Advances in the Regulation of Follicular Development by Extracellular Vesicles and Non-Coding RNAs

JIANG Jun，WANG Dejing

Department of Reproductive Medicine，Department of Obstetrics and Gynecology，Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563000，China

Corresponding author：WANG Dejing  Tel：13984242677，E-mail：2430085462@qq.com

ABSTRACT：Extracellular vesicles （EV），nanoscale vesicles encapsulated by phospholipid bilayers，are rich in biological molecules such as nucleic acids，metabolites，proteins，and lipids derived from parental cells.They are mainly involved in intercellular communication，signal transmission，and material transport and affect the functions of target cells.Ovulation disorders account for a higher proportion in the factors causing infertility which demonstrates increasing incidence year by year.Non-coding RNAs participate in a series of physiological and pathological processes of follicular development，playing a key role in female infertility.This review systematically introduces the types and biological roles of EV and elaborates on the regulation of follicular development from the effects of EV and non-coding RNAs on granulosa cell function，oocyte maturation，ovulation，luteal formation，and steroid hormone synthesis，providing a new idea and a breakthrough point for the diagnosis and treatment of infertility.

Key words：extracellular vesicles；non-coding RNA；biological molecules；follicular development

Acta Acad Med Sin，2023，45（5）：821-826

目前全球育齡夫妇不孕不育发病率高达8％～12％，成为仅次于肿瘤和心脑血管疾病之外的第三大疾病［1-2］。随着我国人口老龄化和出生人口断崖式下降，不孕症的危害不容忽视。排卵障碍是引起女性不孕的主要原因之一，排卵障碍性不孕患者占女性不孕症患者的25%～30%，主要是女性卵泡发育不良或卵泡排卵异常导致。越来越多证据表明卵泡发育的生理和病理过程受细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）及非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA）调控。

EV是从细胞膜上静息脱落或细胞受刺激而释放出来的磷脂双层膜结构的小囊泡，包载源自亲代细胞的生物分子如蛋白质、脂质、核酸及代谢产物等，以自分泌、旁分泌或受体结合等方式运输至靶细胞，可调节靶细胞的表型和生物学功能，有助于细胞间的交流［3-4］。EV还参与细胞存活与凋亡、细胞迁移、血管新生、肿瘤侵袭等生理病理过程。因此，介导生物分子的EV也可作为各种疾病诊断、预后及治疗靶点的重要载体。

EV概述

EV种类  EV可在活细胞上产生和释放，进化后仍保存完好的囊泡，且广泛分布于各种生物流体中，如血液、唾液、脑脊液、尿液及卵泡液等［5］。依据粒径和定义的不同将EV分为4个亚群：外泌体（exosomes，EX）［6］、微囊泡（microvesicles，MV）［7］、凋亡小体［8］和癌小体［9］（表1）。目前研究最多的亚群是EX和MV，但囊泡大小（直径）存在重叠，没有明确特殊标记可以区分出来，因此分离得到的囊泡被研究者统称为EV［10］。

EV生物学功能  EV具有独特能力，可稳定携带大量生物活性分子，并将这些分子经过血液或体液途径远程运输至特定靶细胞，重新编辑翻译成对应靶蛋白，产生生物功能。因此，EV被称为天然运输载体。EV中具有生物活性的蛋白质通常被分为两类：（1）参与囊泡产生过程的保守蛋白质；（2）在信号转导和免疫应答等不同生理病理条件下发挥特异性作用且与细胞来源有关的蛋白质［11］。EV中包含的多种脂质，如甾醇脂质、脂肪酰基脂质、甘油酯、甘油磷脂和鞘脂等，可增强EV在环境中的稳定性，促进与受体细胞的结合或在亲代细胞摄取大分子物质方面发挥作用［12］。

核酸种类颇多，功能广泛，包含DNA和RNA（编码RNA和ncRNA），但对于RNA中ncRNA过去认知甚少，随着全基因组和高通量测序技术高速发展和广泛应用，研究人员发现在人类基因组中约90％的DNA序列可转录产生ncRNA ［13］。近年来研究显示ncRNA在许多生物发展过程中起着重要的调节作用，目前已成为研究热点的小分子物质。ncRNA包含两种类型：基础结构型ncRNA和调控型ncRNA，目前研究与卵泡发育调控有关的ncRNA主要有微小RNA（microRNA，miRNA）［14］、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）［15-16］和环状RNA（circular RNA，circRNA）［17］3大类（表2）。ncRNA中关于miRNA研究颇多，已有多篇文献报道了miRNA在女性生殖系统疾病中作为检测和治疗的关键靶标，但lncRNA、circRNA是否具有同样生物标志物能力，相关研究较少。本文就EV和ncRNA对卵泡发育调控研究进行综述。

EV对卵泡发育调控作用

EV作为天然载体，在机体健康和疾病状态下均能被观察到，通过维持细胞内平衡和在免疫防御过程中发挥作用。有研究发现当机体缺氧、炎症反应、氧化应激等病理因素刺激下EV的产生数量明显增加［18-19］，提示卵泡发育过程发生病理反应时EV含量会出现相应变化，同时ncRNA也会出现异常表达，这些都有可能成为疾病诊断的生物标志物及治疗上新靶点。

近年研究发现，EV由细胞分泌进入细胞外基质，携带的生物分子可调节生殖细胞的发育，通过差异表达的ncRNA参与卵泡发育的各个阶段。多项研究表明，EV-miRNA通过与目标信使RNA结合，转录后调节基因的表达，产生对mRNA降解或抑制翻译的生物功能，参与卵泡相关信号通路，如miR-184可促进靶细胞的增殖，其异常表达也可影响卵泡发育过程中卵巢颗粒细胞（granulosa cell，GC）的增殖。刘辉等［20］发现在多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）患者卵巢GC的EX中miR-184呈高表達，参与卵泡发育病理过程，促使PCOS形成。EV-miRNA参与卵母细胞的成熟过程，研究发现牛卵泡液中EX-miRNA在卵母细胞完全生长直径为4～8 mm时，其上调的miRNA通过泛素介导、神经营养蛋白信号、丝裂原活化蛋白激酶信号和TGF-β信号等通路精确调控着卵泡激素，促进卵母细胞分裂、生长成熟［21-22］。Sang等［23］鉴定出人卵泡液中MV和上清液中均存在miRNA，发现高表达的miRNA可靶向于生殖、内分泌和代谢过程中的相关基因，其中miR-132、miR-320、miR520c-3p、miR-24和miR-222参与调节雌二醇浓度，miR-24、miR-193B和miR-483-5p参与调节孕酮浓度。

目前已知EV-lncRNA和EV-circRNA参与调控卵泡发育的过程，但EV-lncRNA和EV-circRNA对卵泡发育调节的研究仍处于起步阶段。lncRNA在组织细胞表达和发育阶段方面具有较强特异性，通过染色质修饰、RNA结合蛋白和竞争性内源RNA网络的相互作用，促使细胞增殖、分化及凋亡［24］。刘琳等［25］通过高通量测序检测发现卵泡液中的EV-lncRNA存在1866个差异表达lncRNA基因，进一步研究发现差异表达lncRNA在卵母细胞减数分裂以及胰岛素信号通路、胰岛素抵抗中起着重要作用，可能影响着卵泡发育过程。反向剪接的circRNA特殊环状结构可稳定存在于EV中，对miRNA发挥海绵作用，间接调控靶基因，发挥生物学功能。Huang等［26］报道了PCOS组和对照组患者之间卵泡液中EX的circRNA表达谱分析，发现16个circRNA差异表达显著，通过生物信息分析，显示亲本基因富含PCOS相关通路，包括卵巢类固醇生成、醛固酮合成和分泌以及酪氨酸激酶-信号转导与转录激活子（JAK-STAT）信号通路等，进一步体外实验验证circLDLR缺失降低miR-1294功能并抑制CYP19A1表达，降低雌二醇的分泌，从而影响卵泡发育和排卵。

EV可通过调控细胞生长因子表达来诱导卵泡闭锁，如EV调节表皮生长因子在卵泡GC增殖和卵泡细胞成熟过程中发挥显著促进作用［27］。卵泡异常闭锁是影响卵泡发育关键因素之一。在每个性周期过程中会产生大量的卵泡，仅有少许卵泡发育成熟，大多数出现卵泡闭锁，但卵泡异常闭锁会导致PCOS和卵巢早衰等疾病产生。转化生长因子-α在卵泡发育及成熟过程中逐渐出现表达下降，可参与卵母细胞生长、卵泡细胞增殖和黄体细胞凋亡［28］。转化生长因子-β可调节诱导垂体分泌促卵泡生成素，协同促卵泡生成素促进卵泡发育［29］。

ncRNA对卵泡发育调控作用

GC功能、卵母细胞成熟、排卵和黄体形成或甾体类激素合成等过程中任意环节的异常都会导致卵泡发育异常或排卵障碍的出现。不同组织或细胞来源的ncRNA在卵泡发育过程发挥着重要作用。Mu等［30］纳入67篇系统综述和9篇文献荟萃分析显示PCOS患者的血浆、血清、卵泡液、GC等组织中观察到大量变化的ncRNA，失调的ncRNA是PCOS致病的一个重要因素，有可能成为诊断生物标志物和治疗靶点。

miRNA在卵泡发育中作用  GC是组成卵泡的最大细胞亚群。目前多项研究表示，miRNA在转录后水平上负性调节靶基因表达，可解除其对下游靶基因的抑制，使靶基因表达水平上调，完成转录后水平的调控，参与细胞内信号通路转导和调控GC增殖与凋亡。Zhang等［31］研究发现卵巢组织或体外细胞上miR-181a可靶向沉默信息调节因子1下调，诱导叉头框转录因子O亚家族1的去乙酰化酶表达，增强叉头框转录因子O亚家族1表达，促进GC的凋亡。miRNA失调涉及多种疾病，研究发现在肿瘤、炎性疾病、糖尿病或PCOS等疾病中均可观察到miRNA表达水平异常［32］。Sinha等［33］研究发现在体外成熟过程中抑制miR-130b的表达，可减少第一极体的排出，降低卵母細胞达到第二次减数分裂中期的比例和线粒体活性，证明miR-130b参与牛卵母细胞成熟过程。miRNA也影响卵泡排卵，通过与GC中的促卵泡生成素途径相互作用直接来调节卵泡生成［34］。2009年首次证明了miRNA可以调节人类生殖代谢和激素过程，控制卵巢孕激素、雄激素和雌激素增强或抑制释放［35］。基因CYP19A1编码细胞色素P450芳香化酶是雌激素合成的限速酶，miR-199水平高表达可抑制芳香化酶CYP19A1的合成与代谢，导致雄激素过高，抑制卵泡的选择性生长，从而引发PCOS［36］。miR-27a-3p可能通过靶向环磷酸腺苷应答元件结合蛋白1（Creb1），抑制其下游靶基因CYP19A1的信号通路，影响卵泡发育［37］。

lncRNA在卵泡发育中作用  lncRNA可多层面控制基因表达，与miRNA相互作用后共同调节其mRNA靶标，参与创建不同细胞过程的动态调节网络。有研究发现，高龄产妇第二次减数分裂中期（MⅡ）的卵母细胞外围的卵丘细胞上存在差异表达的lncRNA，参与了卵巢卵泡发育和女性生殖细胞成熟关键信号通路的竞争性内源RNA网络［38］。lncRNA在GC中起着关键调控因子作用，如lncRNA HCG26可以抑制细胞增殖和细胞周期进程［39］。Huang等［40］研究lncRNA中的Prader-Willi区域非蛋白编码RNA2（PWRN2），发现PWRN2与PCOS患者的卵母细胞核成熟有关，且通过减少miR-92b-3P与TMEM120B靶结合，影响卵母细胞发育。此外，lncRNA-Y00062参与NEK7基因的调控，而NEK7是纺锤体组装和有丝分裂所必需的基因，lncRNA-Y00062可能在调节卵母细胞减数分裂过程中发挥重要作用［41］。卵泡排卵后受促黄体生长素的作用形成具有内分泌功能的黄体，lncRNA富核转录因子1（Neat1）在此过程中发挥重要作用。有研究表明人绒毛膜促性腺激素（hCG）注射雌性小鼠后，lncRNA Neat1首先表达于窦卵泡的GC上，48 h后在黄体细胞表达达到顶峰，之后逐渐下降，推测其与黄体的形成有关。敲减Neat1基因表达的小鼠出现不能成功怀孕现象，表明lncRNA Neat1基因可影响黄体形成及孕酮分泌，致使生殖功能下降［42］。有研究发现lncRNA参与甾体类激素合成，lncRNA Gm2044作为miR-138-5p的竞争性内源RNA，可解除miR-138-5p对Nr5a1的抑制作用，进而调节17β-雌二醇的合成［43］。

circRNA在卵泡发育中作用  circRNA是一种新型的ncRNA，丰度远高于其同源线性转录本，也是一种稳定存在于多个物种中的宿主基因，可参与多种疾病的进展，主要充当RNA海绵作用。Liu等［44］报道卵巢组织circPSMC3可阻滞细胞周期进程，通过海绵miR-296-3p调节第10号染色体同源缺失性磷酸酶张力蛋白基因（PTEN）来抑制KGN的增殖，促进细胞凋亡。Lu等［45］从不同分子调控机制方面报道沉默circ-RANBP9介导miR-136-5p/XIAP通路抑制GC的增殖，促进细胞凋亡。circRNA作为调节分子，可调控卵泡发育，具有多种生物功能。一项研究显示，差异表达的circRNA相关的宿主基因参与卵泡发育的信号传导途径，如女性GC中差异表达的circRNA-103827和circRNA-104816可能参与有丝分裂细胞周期、葡萄糖代谢，卵巢类固醇生成等信号通路负性调节，造成卵泡微环境受损，抑制了卵母细胞发育成熟的过程［46］。有研究发现卵泡排卵过程中，circAkap17b对miR-7海绵样吸附作用，间接上调靶基因促卵泡激素β亚基的表达并促进促卵泡生成素分泌，影响卵泡排卵［47］。许多circRNA与卵泡发育有关的miRNA可相互作用，Ma等［48］研究发现miR-132与hsa-circ-0043533和hsa-circ-0043532存在潜在的结合位点，miR-132可以抑制人卵巢细胞中孕酮、雌二醇和睾酮的释放，进而推测上调hsa-circ-0043533和hsa-circ-0043532可靶向改变miR-132，抑制PCOS患者体内类固醇激素生成，影响卵泡发育。

总结与展望

EV可从活细胞中分泌，具有天然生物相容性和循环稳定性，作为有效生物载体，庇护生物分子ncRNA穿梭于卵泡发育过程中各个环节不受外界环境影响，发挥调控卵泡生长的作用。ncRNA是功能性RNA，作为EV的信息传递关键调控分子，具有组织和细胞特异性，ncRNA的失调可影响卵泡相关基因的表达，导致卵泡发育异常。miRNA研究目前取得很大进步，已有miRNA成为调控卵泡发育的生物标志物，也为临床治疗提供了新靶点，相信兴起的lncRNA和circRNA同样也可在卵泡发育调控方面成为新的生物标志物和靶点。随着对EV-ncRNA和ncRNA相关卵泡发育的分子机制和信号通路深入探索，相信不久将来临床研究者可为排卵障碍性不孕患者提供更多新的生物标志物和精准治疗靶点，降低不孕症发病率。

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（收稿日期：2022-09-14）