BUB1、DPPA2、P311 在胃癌组织中的表达及与临床特征相关性研究

王玲玲 高敏丽

胃癌在消化系统中发病率较高，是恶性肿瘤死亡原因之一[1]。胃癌细胞多种分子的表达异常在治疗及诊断中有重要意义[2，3]。BUB1是纺锤体检测点的蛋白，在胃癌中染色体的不稳定是由BUB1 表达异常出现细胞恶性情况引起的[4]。多能发育相关基因2（developmental pluripotency associated gene 2，DPPA2）在多能性细胞中发现，在机体发育过程中DPPA2与细胞的多能性有密切关系[5]。胃癌组织中增生性瘢痕相关蛋白（抗原）（P311 protein，P311）蛋白表达量异常增高，且其具体表达量与肿瘤细胞增殖、侵袭、自噬等恶性生物学行为直接相关[6]。本次研究旨在研究BUB1、DPPA2、P311在胃癌组织中的表达及与临床特征相关性，为临床提供数据参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年1 月至2020年1 月在台州市肿瘤医院病理科保存的胃癌组织标本78份，对应78 例患者，全部纳入胃癌组。纳入标准为：符合中国专家共识意见中关于早期胃癌的筛查标准[7]；确诊原发性胃癌；临床资料齐全。其中男性35 例、女性43 例；年龄33～71 岁，平均年龄（49.40±15.45）岁；分期Ⅰ～Ⅱ期28 例、Ⅲ～Ⅳ期50 例；最大直径≤5 cm 26 例，最大直径＞5 cm 52 例；淋巴结转移50 例、无转移28 例；低分化39 例、中分化21 例、高分化18 例。另外选取同期我院病理科保存的正常胃黏膜组织（距离癌组织＞5 cm）标本78份，对应78 例患者，全部纳入对照组，其中男性32 例、女性46 例；年龄31～72 岁，平均年龄（48.93±16.90）岁。排除：伴有其他组织脏器恶性肿瘤性疾病的患者；伴有心肝肾功能严重损害的患者；合并全身感染性疾病的患者；妊娠期、哺乳期的患者；恶液质无法忍受手术创伤的患者；精神异常的患者。两组研究对象性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。本次研究经过本院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化 通过聚合物技术（EnVision）对胃癌组织、正常胃黏膜组织中的BUB1、DPPA2、P311进行检测。取胃癌组织、正常胃黏膜组织蜡块切片，经过烤片后，采用乙醇进行脱蜡、水化，洗涤液清洗4 次，每次4 min。将稀释的柠檬酸盐缓冲液加入到微波盒中，然后微波加热到沸腾，将脱蜡水化后的胃癌组织切片放置到耐热塑料切片架上，随后将其放入上面的缓冲液中，10 min后，微波盒自行冷却后，从缓冲液中将切片取出，采用蒸馏水进行冲洗，洗涤液清洗3 次，每次3 min。随后分别将3%H2O2加入到各切片中，在37 ℃的温度下处理10 min，洗涤液清洗4 次，每次4 min。在各切片中分别加入1 滴相应的第一抗体，在37 ℃的温度下处理2 h，在缓冲液中将各切片取出，采用蒸馏水进行冲洗，洗涤液清洗3 次，每次3 min。将BUB1、DPPA2、P311 分别加入到各切片中，在37 ℃的温度下处理20 min，洗涤液清洗4 次，每次4 min。在各切片中分别加入1 滴新配制DAB 液，采用显微镜对其进行观察分析。采用苏木精对其进行第二次染色，然后对其进行分化、冲洗、蓝化，采用酒精对其切片进行脱水，然后进行晒干观察，采用对应的免疫组化试剂盒对三种不同的基因进行免疫组化检测。

1.2.2 阳性结果判定 在显微镜下随机选取5 个高倍视野的切片，选取的每张切片细胞数量不低于100 个，由我院病理科两位资深的医师对阳性细胞的染色情况进行统计，有分歧时，一起讨论并达成一致意见。细胞染色强度评分标准：0 分：细胞几乎没有颜色，1 分：浅黄色，2 分：棕黄色，3 分：棕褐色。切片阳性细胞所占百分比评分标准；0 分：200 倍阳性细胞率＜15%，1 分：15%～29%，2 分：30%～54%，3 分：55%～76%，4 分：＞76%。将阳性细胞所占百分比与切片BUB1、DPPA2、P311细胞染色强度进行相乘，0 分为阴性（-）；1～2 分为弱阳性（+）；3～4 分为中度阳性（++）；＞4 分为强阳性（+++）。

1.3 随访 所有患者随访至2021年9 月，统计患者生存情况。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行数据处理。BUB1、DPPA2、P311 蛋白阳性表达组和阴性组患者术后总体生存时间分析采用Kaplan-Meier 法，相关性分析采用Spearman相关法。计数资料采用百分率描述，组间比较采用χ2检验。设P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织中BUB1、DPPA2、P311阳性表达比较见表1

由表1 可见，与对照组相比，胃癌组BUB1、DPPA2、P311 阳性表达率较高，差异有统计学意义（χ2分别=31.45、66.96、37.12，P均＜0.05）。

2.2 不同临床特征患者BUB1、DPPA2、P311阳性表达比较见表2

表2 不同临床特征患者BUB1、DPPA2、P311阳性表达比较/例（%）

由表2 可见，不同性别、年龄患者的BUB1、DPPA2、P311 阳性表达比较，差异无统计学意义（χ2分别=0.55、0.51、0.57；1.24、0.51、2.28，P均＞0.05）。与肿瘤分期Ⅰ～Ⅱ期患者相比，Ⅲ～Ⅳ期患者BUB1、DPPA2、P311 阳性表达率较高，差异有统计学意义（χ2分别=11.17、10.45、11.57，P均＜0.05）。与肿瘤最大直径≤5 cm 患者相比，肿瘤最大直径＞5 cm 患者BUB1、DPPA2、P311 阳性表达率较高，差异有统计学意义（χ2分别=13.79、12.90、17.28，P均＜0.05）。与无淋巴结转移患者相比，有淋巴结转移患者BUB1、DPPA2、P311 阳性表达率较高，差异有统计学意义（χ2分别=19.86、15.61、24.14，P均＜0.05）。不同分化程度的患者BUB1、DPPA2、P311阳性表达率比较，差异有统计学意义（χ2分别=12.78、11.81、11.63，P均＜0.05）。

2.3 BUB1、DPPA2、P311表达生存曲线见图2

图2 BUB1、DPPA2、P311阳性与阴性表达生存曲线

由图2 可见，BUB1、DPPA2、P311 阳性表达的胃癌患者中位生存时间明显低于其阴性表达患者。

2.4 胃癌组织BUB1、DPPA2、P311蛋白表达量的相关性 胃癌组织BUB1与DPPA2蛋白表达量呈正相关（r=0.71，P＜0.05）；胃癌组织BUB1与P311蛋白表达量呈正相关（r=9.70，P＜0.05）；胃癌组织DPPA2与P311蛋白表达量呈正相关（r=0.36，P＜0.05）。

3 讨论

胃癌在我国临床中是较为常见的一种恶性肿瘤，其发病率以及死亡率呈现不断上升的趋势，不断探索胃癌的发展机制以及发病原因具有重要的意义[8]。胃癌的发生发展与多种因素、阶段有一定的关系，环境危险因素导致基因表达的异常，进而形成生物学功能的改变，环境与基因相互影响会使胃癌进一步恶化[9]。最新研究表明，某些特定分子阳性表达的改变与胃癌的发生发展具有密切的关系，其分子阳性表达的改变是导致胃癌细胞恶化程度发展的重要原因，进而导致肿瘤侵袭的转移[10，11]。本次研究旨在研究BUB1、DPPA2、P311在胃癌组织中的表达及与临床特征相关性，为研究胃癌发病机制提供参考。

BUB1 在细胞有丝分裂中是纺锤体检查点系统的一个主要组成部分，它在纺锤体形成微管过程中与染色体动粒结合时具有参与的作用[12]。在有丝分裂中当微管正确结合到动粒上时，丝粒相关蛋白E的构象可能发生一些改变，使BUB1 的活性受到一些影响，进而使细胞周期正常运行[13，14]。本次研究发现，不同年龄、性别患者BUB1 阳性表达没有差异，说明BUB1表达与胃癌患者性别、年龄无关。在本次研究中，在Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤最大直径＞5 cm 的患者BUB1阳性表达较高，表明在胃癌组织中BUB1阳性表达随肿瘤分期、最大直径增加而增加。有研究证实，BUB1在肾癌组织中阳性表达是高表达，胃癌的发生发展与BUB1异常表达有密切的关系[4]，本次研究与其保持一致。本次研究结果显示，肿瘤淋巴结转移、分化与胃癌组织中BUB1 的表达有一定的关系，提示BUB1 表达异常可能参与胃癌患者发病的过程。

DPPA2 主要是由298 个氨基酸残基组成的多肽进行编码，进化保守序列SAP 结构域存在于DPPA2的氨基端上，它是由疏水氨基酸和极性氨基酸两部分组成，有研究发现，SAP结构域剔除后会对ZAR1L 表达进行抑制，会使受精卵的分裂过程停止，同时导致染色体结构和组蛋白去甲基化重新构建组织，进而影响生殖细胞的发育[15，16]。本次研究中，DPPA2 阳性表达与患者性别、年龄无关。在Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤最大直径＞5 cm、淋巴结有转移、高分化程度的胃癌组织中DPPA2阳性表达是高表达，提示DPPA2表达异常与胃癌患者严重程度有关。

P311 主要存在于胶质母细胞瘤组织且浓度较高，其在黏着斑蛋白等迁移相关蛋白过程中具有参与的作用[17]。非小细胞肺癌组织中的P311 与癌细胞浸润程度中有一定的关系，对成纤维母细胞在创伤肌肉组织中的迁移具有促进的作用[18]。有研究认为，在胃癌细胞内的增殖侵袭过程中P311蛋白可能发挥出重要作用[19]，但是目前P311蛋白在胃癌细胞中的作用机制研究较少。本次研究中，P311在胃癌组织中呈高表达，说明P311基因表达异常是胃癌发生发展的重要因素。P311 表达与患者的性别和年龄无关。在Ⅲ～Ⅳ期、肿瘤最大直径＞5 cm的患者P311阳性表达较高，提示P311表达异常可能与胃癌患者发病的过程有一定的关系。研究表明，肿瘤细胞恶性程度增加以及发生远处转移的主要原因是侵袭迁移，侵袭基因的表达异常会导致分子基础的改变[20]。本次研究结果表明，在胃癌患者中肿瘤淋巴结转移以及分化程度越严重，P311 表达越高，进一步说明了P311 蛋白阳性表达与胃癌发生发展有密切的关系。本次研究BUB1、DPPA2、P311阳性表达的胃癌患者其中位生存时间明显低于其阴性表达患者，表明BUB1、DPPA2、P311 对胃癌的预后具有一定的价值。进一步相关性分析，BUB1、DPPA2、P311的蛋白表达量都呈正相关，证明胃癌的胃癌恶性程度、淋巴结转移趋势及预后密切相关。

综上所述，胃癌患者胃癌组织在Ⅲ～Ⅳ期、最大直径＞5 cm、有淋巴结转移、分化程度较高时BUB1、DPPA2、P311 阳性表达较高，说明BUB1、DPPA2、P311阳性表达与胃癌病情的严重程度有密切的关系，可能参与胃癌患者病情发展过程，为研究胃癌发病机制及患者预后提供参考。