胞内寄生菌对巨噬细胞免疫逃逸的研究进展①

田 丽 吴显伟 周 伟 张惠勇 张少言 鹿振辉 （上海中医药大学附属龙华医院，上海 200030）

病原微生物侵袭机体后，机体内固有免疫系统首先启动。巨噬细胞通过定位于细胞表面、囊泡或细胞质基质的模式识别受体（pattern recognition receptor，PRRs）识别病原微生物感染，通过吞噬体的内吞作用迅速吞噬病原微生物，再与溶酶体融合形成吞噬溶酶体。吞噬溶酶体具有酸性、氧化性等利于降解微生物的管腔，含有多种抗菌分子，如蛋白酶、活性氧（reactive oxide species，ROS）、活性氮等，具有强大的杀伤微生物能力。而很多病原微生物发展出逃避巨噬细胞消化、消除的能力，从而在宿主细胞内长期存活。

细胞内病原体通常分为兼性胞内菌和专性胞内菌两类［1］。兼性胞内菌既可在宿主细胞内繁殖、存活，又可在体外无生命的培养基中生长；专性胞内菌仅能在宿主活细胞内生长繁殖［2］。根据病原体逃逸生存环境又可分为液泡病原体和胞质病原体，液泡病原体利用宿主膜运输在液泡中构建特定生态位，胞质病原体是从液泡逃逸至细胞质基质的病原体，在细胞质基质增殖并可扩散到邻近细胞［3］。这些病原体具有一系列毒力因子以及复杂的调节因子网络，通过在吞噬细胞内复制或分泌效应子改变宿主细胞，创造适宜自身增殖的环境，逃避宿主免疫应答和抗生素攻击。本文对胞内感染常见的细菌和真菌对巨噬细胞的免疫逃逸策略进行简要概述（表1）。

表1 胞内感染常见的细菌和真菌对巨噬细胞的免疫逃逸策略Tab.1 Immune escape strategies of common intracellularly infected bacteria and fungi against macrophages

1 细菌免疫逃逸

细胞内细菌通常是临床相关病原体，几乎感染宿主机体发现的每种细胞类型，尤其是巨噬细胞。巨噬细胞作为免疫系统的哨兵，第一时间将入侵的细菌吞噬并清除，而结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）、单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes，Listeria）、沙门菌（Salmonella）、衣原体（Chlamydia）和立克次体（Rickettsia）等细菌通过多种策略逃避宿主巨噬细胞吞噬，在宿主细胞中复制和长期存活，引起感染性疾病。

1.1MTBMTB通过操纵宿主效应机制，包括抑制吞噬体成熟、吞噬体和溶酶体融合、自噬和氧化代谢途径等建立持久感染。MTB具有含甲基支链脂肪酸的复杂细胞膜，可保护自身免受宿主酶伤害［4］。此外MTB的结构特征及其菌丝体组成抑制巨噬细胞吞噬体成熟和酸化［5］。MTB还通过运输毒素脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）以及依赖钙调素的PI3P抑制吞噬体和溶酶体融合过程［6］。Mycothiol是MTB的一种主要硫醇，具有抗氧化活性，可帮助MTB抑制宿主细胞内氧化应激，产生免疫逃逸，延长MTB在巨噬细胞中的存活时间。而一些MTB菌株在巨噬细胞的内吞泡内无法适应存活时，这些MTB可通过激活磷脂在细胞质中创造有利生存条件［7］。非结核分枝杆菌（Nontuberculosis mycobacteria，NTM）也被证明可调节宿主免疫应答，包括防止吞噬体酸化和成熟或从吞噬体逃逸到营养丰富的细胞质基质，从而在宿主细胞内长期存活［8］。

1.2S.aureusS.aureus是一种革兰阳性机会致病菌，轻者导致皮肤感染，严重者可造成危及生命的菌血症和脑膜炎。S.aureus是皮肤和软组织感染以及院内和社区获得性肺炎最常见的病原体之一［9］。巨噬细胞可吞噬多数入侵的S.aureus，并采用多种杀伤机制杀死S.aureus。但一些S.aureus可在中性粒细胞和巨噬细胞吞噬后存活，还可逃避和操纵巨噬细胞，其兼性细胞内寄生的特点和表面生物膜保护其免受宿主免疫应答和抗生素作用，甚至可在多种非吞噬细胞，如上皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞和肥大细胞等细胞内长期存活［10-11］。一旦进入巨噬细胞，S.aureus就会利用宿主细胞新陈代谢调节细胞代谢通量，消耗宿主细胞葡萄糖和氨基酸确保其自身增殖。S.aureus还可在宿主细胞吞噬体或细胞质内自由复制，逃脱专业和非专业吞噬细胞的吞噬小体，破坏自噬，诱导细胞凋亡和脓毒坏死等死亡机制，甚至可诱导吞噬细胞抗凋亡程序。MSCRAMMs（识别黏附基质分子的微生物表面成分）的蛋白质黏附素使S.aureus黏附于宿主细胞产生的各种细胞外基质蛋白或直接黏附于宿主细胞［12］。

1.3ListeriaListeria是革兰阳性菌，是一种机会性食源性感染病原体，可引起严重的局部和全身感染［13］。Listeria是一种典型的胞质内病原体，可侵袭巨噬细胞和非吞噬细胞，如胃肠道上皮细胞［14］。可通过入侵肠道上皮M 细胞穿透宿主，被宿主巨噬细胞捕获。Listeria主要依赖于典型的Sec 易位系统分泌毒力因子，其分泌的毒力因子溶血素帮助Listeria逃离吞噬体［15-16］。转录因子PrfA是Listeria毒力的主要调节剂，可诱导伴侣PrsA2 和伴侣/蛋白酶HtrA 分泌。两者的蛋白折叠和稳定功能可促进Listeria在巨噬细胞感染期间适应和存活［9］。Listeria还可利用肌动蛋白装配诱导蛋白ActA 诱导细菌表面肌动蛋白聚合驱动细菌，并在成孔毒素ListeriolysinO（LLO）与磷脂酶C（PI-PLC和PC-PLC）帮助下逃离吞噬细胞液泡，逃逸至胞质内存活。LLO 还导致Ca2+内流，阻止晚期核内体和/或溶酶体与含病原体液泡融合［3］。CadA是一种具有镉抗性的外排泵，CadC是CadA 的序列特异性、DNA 结合和镉依赖性调节剂。Listeria可通过CadC调节镉外流、微调脂蛋白定位逃避宿主免疫应答并促进感染［17］。

1.4SalmonellaSalmonella是杆状兼性厌氧菌，是一种最常见的食源性病原体。Salmonella可通过巨噬细胞引发自身吞噬作用并被包裹在含Salmonella的液泡SCV 中，逃避细胞外各种免疫应答［18-19］。SPI是沙门氏菌编码毒力相关基因特定区域，其编码效应子在Salmonella侵入巨噬细胞和上皮细胞中起重要作用，可帮助Salmonella感染期间的膜侵袭，还可促发SCV，降低溶酶体酶活性，干扰内体到溶酶体的运输，阻止两者融合。SPI 的编码效应子还可掩盖细菌表面抗原，导致吞噬细胞表面PRRs 无法识别。此外还可抑制固有免疫，减少促炎介质产生，导致吞噬细胞清菌效率低下［19］。致病性Salmonella菌株表达2 个Ⅲ型分泌系统（T3SSs），包括T3SS1 和T3SS2。研究表明，细菌内化初期T3SS2表达随时间增加，与SCV 成熟一致［20］。T3SS2 易位的效应蛋白将局部黏着斑激酶（FAK）和蛋白激酶B（Akt）招募到SCV 表面，Akt 活化后可通过磷酸化mTORC1 抑制巨噬细胞自噬［21］。

1.5ChlamydiaChlamydia是一种革兰阴性专性胞内菌，可引起人类和动物严重感染［22］。其中曲霉衣原体是一种性传播细菌感染的病原体，还是导致致盲性沙眼的病原体［23］；而肺炎衣原体经常引起社区获得性肺炎。Chlamydia以细菌基本体（element basic，EB）形式附着并侵入宿主细胞中［24］。新生的吞噬细胞区室被衣原体衍生的蛋白迅速修饰，产生称为包涵体的寄生液泡，从而避免与溶酶体融合，使Chlamydia在感染早期就从宿主巨噬细胞的内吞途径逃离。EB进入细胞后，将Ⅲ型分泌效应器易位肌动蛋白募集磷酸蛋白（translocation actin recruits phosphoproteins，TARP）转移到宿主细胞膜，利用宿主细胞骨架发挥其优势，促进包涵体生成，并助其从细胞膜挤出，使之从宿主细胞中排出［25-27］。包涵体中，EB 迅速分化成网状体（reticulate body，RB）进行复制，通过细胞裂解和/或挤出释放最终与宿主巨噬细胞分离，引发新一轮感染［28］。胞内Chlamydia还可通过干扰宿主细胞信号阻断固有免疫信号传导抑制细胞凋亡。

1.6RickettsiaRickettsia是革兰阴性专性胞内细菌，可入侵各种真核生物。Rickettsia同Listeria、志贺菌（Shigella）、伯克霍尔德菌（Burkholderia）和弗朗西斯菌（Francisella）等细菌一样，通过巨噬细胞吞噬内在化，随后病原体逃逸到宿主细胞质存活［29］。作为一种专性细胞内细菌，Rickettsia需要黏附并入侵靶细胞从而获得营养丰富的细胞质生态位，促进自身在宿主细胞内增殖、复制和传播，从而在宿主中成功建立感染。Rickettsia通过一种“拉链状”诱导内吞过程进入哺乳动物宿主细胞，其入侵宿主需要特异性受体配体参与，入侵的关键分子为表面细胞抗原（Scas）［30］。入侵还需宿主特异性信号级联劫持，最终导致宿主肌动蛋白细胞骨架和膜动力学重排，帮助细菌入侵。内吞后不久，Rickettsia利用其分泌性膜溶解效应物，包括溶血素和磷脂酶，破坏吞噬体膜，并逃逸到宿主细胞质避免吞噬体-溶酶体融合，在宿主细胞质中完成生长和复制，随后直接进入邻近细胞进行新一轮感染［31］。

2 真菌免疫逃逸

全球真菌有350 万～510 万种，其中约600 多种真菌可感染人类并引起疾病［32-33］。多数人一生中都会遭遇浅表真菌感染，如感染指甲的皮肤癣菌以及感染皮肤或黏膜的念珠菌属。每年也有数百万人会感染危及生命的侵袭性真菌，具有易误诊、治疗周期长和病死率高等特点。侵袭性真菌感染大多由4 种真菌属引起：烟曲霉（Aspergillus fumigatu，A.fumigatu）、白色念珠菌（Candida albicans，C.albicans）、隐球菌（Cryptococcus）和耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovrcii）［34］。这些侵袭性真菌感染人体后能够逃避宿主免疫系统识别和清除，在宿主体内散播并造成持续感染。

2.1A.fumigatuA.fumigatu是一种普遍存在的腐生菌，经呼吸道吸入定植于肺部，可导致免疫缺陷个体致命的肺部感染，90%以上侵袭性曲霉病由A.fumigatu导致。A.fumigatu分生孢子细胞壁表面主要由疏水棒状蛋白和二羟基萘（DHN）-黑色素构成［35］。棒状蛋白层和黑色素均被认为是免疫惰性分子，可掩盖病原体相关分子模式，避免自身被吞噬细胞表面PRRs 识别［36-37］。黑色素还可抑制吞噬细胞内ROS 产生，保护其免受宿主细胞内氧化应激干扰，并抑制吞噬体酸化以及吞噬体溶酶体融合，从而抑制吞噬细胞吞噬作用，减弱宿主固有免疫效应［38］。LC3 相 关 自 噬（C3-associated phagocytosis，LAP）在吞噬细胞杀伤A.fumigatu的免疫效应中发挥重要作用，其发挥作用需要NADPH 氧化酶激活。黑色素可通过去除吞噬体中的1 个亚单位p22phox而抑制NADPH 氧化酶依赖性LAP 激活，从而阻断LAP 通路，抑制NADPH 氧化酶激活［39］。Ca2+和CaM是自噬关键调控因子，Ca2+-CaM信号可调节LAP通路。黑色素还可将Ca2+在吞噬小体内隔离，阻断CaM 募集和LAP通路，抑制巨噬细胞自噬效应发生［40］。

2.2C.albicans念珠菌属是最常见的人类病原真菌。C.albicans是人类侵袭性病原真菌，可引起免疫功能低下患者黏膜感染以及致命的散播性感染，50%以上念珠菌属感染由C.albicans导致。C.albicans酵母-菌丝形态转换能力是其逃避巨噬细胞等固有免疫细胞吞噬所必需的［41］。C.albicans可通过劫持典型的炎症小体-GSDMD 轴介导的焦亡、表达念珠菌素Ece1 进行细胞打孔以及形成菌丝等策略促进自身逃离巨噬细胞［42］。C.albicans还可抑制胞内ROS 生成和超氧化物歧化酶等解毒酶产生进而抵消巨噬细胞内氧化/亚硝化反应［43-44］。此外，C.albicans可通过诱导宿主精氨酸酶活性阻断巨噬细胞中NO产生，逃避巨噬细胞免疫清除［45-46］。

2.3Cryptococcus隐球菌属新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）和格特隐球菌（Cryptococcus gattii）是担子菌门最重要的两个侵袭性病原真菌，在环境中广泛存在。Cryptococcus孢子或干燥细胞可经呼吸道被人体吸入，在健康人群中引起肺部感染，并散播至脑，导致危及生命的隐球菌性脑膜炎。Cryptococcus可通过形成体积巨大的泰坦细胞或通过真菌表面荚膜抗吞噬细胞特性避免巨噬细胞摄取［47］。荚膜多糖（capsular polysaccharides，CPs）被认为是Cryptococcus neoformans和Cryptococcus gattii的重要毒力因子，通过覆盖真菌表面特定病原体相关模式分子（pattern recognition recepters，PAMPs）避免被抗原提呈细胞识别实现免疫逃避［48］。Cryptococcus还可分泌漆酶和黑色素中和吞噬细胞内ROS 和pH值，使其适应吞噬细胞内恶劣的环境，帮助其自身在宿主细胞中定植，并在吞噬细胞中自由复制［49］。Cryptococcus还可通过非溶性胞吐作用促进在宿主中的存活，将其液泡与细胞膜融合，逃避巨噬细胞溶酶体降解［50］。

2.4Pneumocystis jirovrcii肺孢子菌（Pneumocystis）是一种机会性真菌病原体，定植于人类肺部的为Pneumocystis jirovrcii，可在免疫功能低下患者中引起危及生命的肺孢子菌肺炎（Pneumocystispneumonia，PCP），发病率逐年上升。宿主PRRs 的C 型凝集素受体（C-type lectin receptor，CLRs）中的葡聚糖受体Dectin-1 可识别Pneumocystis细胞表面β-葡聚糖，在固有免疫信号传导和真菌清除中发挥重要作用［51］。Pneumocystis细胞表面的主要糖蛋白（major surface glycoprotein，MSG）可降低Dectin-1 表达，抑制CLR对其的识别，逃避巨噬细胞吞噬［52］。研究发现Pneumocystis细胞表面缺乏几丁质、外链N-甘露聚糖，而表面β-葡聚糖常被Msg和其他表面蛋白掩盖。几丁质、外链N-甘露聚糖以及β-葡聚糖都是已知的PAMPs，其缺失或掩盖有助于逃避或延迟固有免疫系统对Pneumocystis的识别［53］。

3 总结

综上，巨噬细胞作为主要的免疫哨兵细胞，在识别和吞噬入侵病原体、发挥免疫效应方面具有重要作用。细胞内病原体被巨噬细胞吞噬后，进化出多种防御机制，躲避宿主免疫攻击，并在宿主细胞内长期存活。其中细胞内细菌主要通过抑制吞噬体成熟、吞噬溶酶体融合、自噬及氧化反应，还可重排或利用细胞骨架促进其对巨噬细胞的逃逸；细胞内真菌的巨噬细胞免疫逃逸策略主要为通过细胞壁表面成分掩盖PAMPs，避免被PRRs 识别躲避巨噬细胞吞噬。还可通过毒力因子和改变自身形态或大小增强在宿主细胞的存活能力。目前虽已明确以上几种常见胞内寄生菌的免疫逃逸机制，但对其认识仍处于探索阶段，有待进一步研究。