利用CRISPR/Cas9 系统构建SIRT1 基因敲除的K562 细胞株

温后烺，陈 婧，曾杰清，彭流泉，陈日玲，马国达，张海涛，汪亚君*（.广东医科大学顺德妇女儿童医院，广东佛山 58300；.广东医科大学生化教研室，广东湛江 5403）

慢性髓系白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤，约占成人白血病的15%，是一种造血系统的恶性疾病，严重危及患者的生命[1]。在过去的几十年中，科学家们致力于寻找治疗白血病的方法，然而对这种疾病的分子复杂性、药物的最佳排序、不良事件的管理以及成功停止治疗的标准仍未达成一致意见[2]。这是因为白血病的发病机制仍未完全明了，有效的细胞模型对于研究白血病的分子机制和药物效应十分重要。

沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是III 类组蛋白去乙酰化酶sirtuins 家族成员。SIRT1 可以调节大多数血液肿瘤的生存途径。SIRT1 失调在白血病发生中的起着重要作用，特别是在CML中，可被BCR-ABL和KRAS癌基因激活[3-4]。由BCR-ABL 激活的SIRT1 影响CML 分子病理的多个方面，如CML祖细胞存活、获得性突变、肿瘤发展和药物抵抗等。从慢性CML到疾病晚期，随着SIRT1表达的进一步增加，SIRT1 调节的易出错的DNA修复可能是CML 进化到更高恶性状态的基础[3-5]。此外，SIRT1 促进CML 细胞获得BCR-ABL 突变，以抵抗酪氨酸激酶抑制剂[6]。抑制SIRT1 可选择性地降低CML 的白血病干细胞（Leukemia stem cells,LSC）的生存和增殖，并使它们对酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors，TKI）治疗敏感[7]，提示抑制SIRT1 可能是清除CML 患者LSC 和增强TKI 疗效的一种潜在策略。

近年来，CRISPR/Cas9 系统被广泛应用于基因编辑领域，且被认为是一种非常有前途的技术[8]。利用CRISPR/Cas9 系统，科学家可针对特定的基因进行定点突变、敲除或修饰，从而进一步理解这些基因在生物体中的功能。K562 细胞是第一个人红白血病细胞系，在丁酸钠、羟基脲等诱导下，它可向红系分化；在佛波酯作用下,可向巨核系分化；在六亚甲基双乙酰胺诱导下，又可向单核巨噬细胞系分化，是研究包括CML在内的血液系统疾病很好的细胞模型。在K562 细胞中敲除SIRT1 基因，有助于更深入地研究SIRT1 在白血病中的作用及分子机制。在本研究中，我们将利用CRISPR/Cas9 系统构建SIRT1 基因敲除的K562 细胞株，旨在为白血病的分子机制研究提供更好的细胞模型。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

人红白血病细胞K562（由本实验室保存）。RPMI 1640 培养基、胎牛血清、100X 青-链霉素、Lipo3000转染试剂，人SIRT1 第一抗体，RNA 提取试剂盒，Realtime PCR反应试剂盒，均从锐竞采购平台购买。

1.2 实验方法

1.2.1 SIRT1 敲除载体的设计与获取 根据CRISPR/Cas9 设计原则，登陆CRISPR/Cas9 设计网站https://zlab.bio/guide-design-resources，输入人SIRT1 基因后，根据网站生成的序列，选择一对互补的靶向SIRT1 基因第5 个外显子（SIRT1 的酶活性中心）的sgRNA 并合成，sgRNA 的序列为：AGAGATGGCTGGAATTGT CC，在sgRNA序列的正向链5’端添加AACG-，反向链5’端添加-ACAG。合成的sgRNA退火后插入酶切后的质粒PB-CRISPR（Addgene 160047），构成重组质粒PBSIRT1-sgRNA质粒（SIRT1 基因敲除质粒）。该质粒可在哺乳动物细胞中同时表达Cas9、目的基因的sgRNA和puromycin抗性基因。

1.2.2 质粒转染和有效性验证 按照每孔5×105个细胞接种K562 细胞到12 孔板，24 h 后采用lipo3000脂质体转染试剂分别转染2 μg SIRT1 基因敲除质粒pLenti-SIRT1-sgRNA 或无靶向的对照质粒pLenti-Control-sgRNA，转染24 h 后更换新鲜培养液继续培养。细胞转染48 h后，250 g离心收集细胞，按照DNA提取试剂盒说明书分别提取转染组和野生组细胞的基因组DNA，并送上海生工测序，检测SIRT1 第5 外显子附近基因序列。

1.2.3 嘌呤霉素筛选 常规接种野生型K562 细胞于12 孔板，24 h 后依照0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、1、2 mg/L的终质量浓度加入嘌呤霉素继续培养，每天观察细胞数量，选择72 h能够杀死所有细胞的最小质量浓度作为细胞筛选质量浓度。质粒转染48 h后更换为含有嘌呤霉素的培养基筛选阳性细胞，筛选3 d 后收集部分细胞用于免疫印迹检测目的基因表达，部分细胞继续培养用于筛选稳定表达的单克隆细胞株。

1.2.4 免疫印迹 300 g离心收集细胞，PBS洗涤后，加入含有PMSF 和蛋白酶抑制剂的细胞裂解液冰上裂解30 min，10 000 g离心去除细胞碎片。以上获得的细胞裂解液经BSA 定量，上样至经聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白转移到PVDF 纤维素膜上，经抗人SIRT1 第一抗体以及辣根过氧化物酶第二抗体孵育后，采用凝胶成像仪成像分析蛋白相对表达量，以β-Actin作为内参。

1.2.5 单克隆的筛选和扩增 收集筛选后存活的细胞，细胞计数后按照每10 个细胞/mL的标准稀释，混合后接种到96 孔板，平均每孔1 个细胞。细胞接种在显微镜下观察单细胞的孔并标记。克隆生长2 周后，显微镜下选择已充分扩增的克隆转移到24 孔板继续扩增。

1.2.6 单克隆基因组PCR 检测 待细胞生长至足够的数量后，采用天根基因组DNA提取试剂盒根据说明书基因组DNA，采用Blast设计的引物扩增包含SIRT1第5 外显子的基因片段。引物序列如下：5’-TGCATA TGACAGCAACCGTC-3’；5’-TTCTCGATGGCAGTC AGCTT-3’；PCR条件如下：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25 个循环；72 ℃ 1 min。

1.2.7 细胞增殖分析 取对数生长期的待测细胞，接种到96 孔板中，每孔含约1×104个细胞，每天取1 组细胞，每孔加入10 μL CCK8 试剂，置于培养箱中避光再孵育2 h，用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值并绘制细胞增殖曲线，每组设3 个重复。

1.3 统计学处理

采用 SPSS 25.0 软件和 Prism 9 软件进行统计学处理。计量资料以均数±标准差表示，采用独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质粒载体构建

采用上述方法构建质粒PB-CRISPR-KOSIRT1，本文通过DNA测序验证sgRNA编码序列。如图1 所示，质粒中的插入序列与我们设计的sgRNA编码序列：5’-AGAGATGGCTGGAATTGTCC-3’一致。

图1 sgRNA编码序列测序结果

2.2 细胞转染验证

PB-CRISPR-KOSIRT1 质粒扩增后转染K562 细胞。增殖旺盛期的K562 细胞接种于6 孔板，取4 μg的质粒用Lipo3000 转染到细胞，转染24 h后换液，48 h后收集细胞提取基因组DNA，对SIRT1 第5 外显子附近的序列进行测序鉴定。结果显示，与野生型细胞相比，转染组在第5 外显子起始位置，即sgRNA配对位置出现复合峰，提示该位置出现序列变异（图2）。

图2 野生型和PB-CRISPR-KOSIRT1 质粒转染的K562 细胞基因组测序结果

图3 K562 细胞嘌呤霉素筛选结果

2.3 细胞筛选

为筛选出稳定插入质粒的细胞，避免质粒的敲除效应在细胞传代中丢失，本文拟筛选稳定转染的单克隆细胞株。

2.3.1 药物筛选质量浓度的确定 为确定最适合的筛选药物质量浓度，本文在12 孔板常规接种K562 细胞，并于24 h后分别加入0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.5、1、2 mg/L的嘌呤霉素进行筛选，选择72 h能够杀死所有细胞的最小药物质量浓度为应用质量浓度。结果显示，72 h杀死细胞的最小质量浓度为2 mg/L（图3）。

2.3.2 筛选后免疫印迹鉴定 转染的细胞经筛选和扩增2 周后，收集并裂解细胞，用免疫印迹法鉴定SIRT1蛋白的表达情况。结果显示野生型和空载体转染组（Con）SIRT1 均可正常表达，而目标敲除质粒转染组（KO）SIRT1 表达几乎检测不到（图4）。

图4 免疫印迹检测SIRT1 的表达

2.4 单克隆细胞的获取

本文采用有限稀释法在96 孔板接种单克隆细胞。K562 细胞作为一种半贴壁细胞，不易形成稳定的单克隆簇，为改善细胞的贴壁和克隆形成情况，本文用0.1%的明胶预处理培养板，经过7 d的生长后，96 孔板形成了多个细胞单克隆，SIRT1 敲除组克隆形态整体上较空载体组小（图5）。

图5 细胞单克隆7 d后的形态

2.5 SIRT1 基因敲除细胞的特征检测

为进一步明确获得的SIRT1 基因敲除单克隆细胞的特征，本文分别提取以上单克隆细胞的基因组DNA，用PCR的方法扩增了包含第5 外显子的SIRT1基因片段，凝胶电泳结果显示所有克隆均可扩增出与野生型大小一致清晰的条带，说明该区域基因组没有发生大片段的缺失突变（图6A）；细胞裂解物免疫印迹显示，敲除的克隆KG3、KC5 和KB7 均几乎观察不到SIRT1 蛋白的表达（图6B），CCK8 法对这几个单克隆细胞的生长曲线分析显示SIRT1 基因敲除导致细胞不同程度地增殖减缓（图6C）。

图6 单克隆细胞的特征检测

3 讨论

本文利用CRISPR/Cas9 系统成功构建了SIRT1基因敲除的白血病单克隆细胞株，并对敲除效果进行了测序分析和蛋白表达分析，验证了该方法在实现基因敲除上的有效性。该细胞株遗传背景清晰，敲除效果明确，为研究SIRT1 基因在血液疾病中的功能研究研究提供了有用的工具。

本文采用了CRISPR/Cas9 技术进行基因敲除。相比于传统的基因敲除方法，CRISPR/Cas9 系统可以靶向识别和位点特异性DNA切割，具有更高的准确性和效率，是非常强大的基因编辑工具[9-11]。CRISPR/Cas9载体包含Cas9 蛋白表达序列和gRNA序列，人工设计的gRNA前部被称为sgRNA，负责识别目标位点，下面的部分作为与Cas9 蛋白结合的支架。当CRISPR/Cas9载体被导入靶细胞后，会表达Cas9 和gRNA，进行靶向基因识别和DNA切割，实现基因敲除的目的[9,12]。在基因敲除后，本文通过测序分析和蛋白表达分析来验证基因敲除的效果。这些分析结果证实了SIRT1 基因已被成功敲除，为后续研究提供了强有力的实验基础。

关于细胞生长速度缓慢的现象，笔者认为SIRT1敲除可能引起细胞的应激反应和代谢紊乱，从而导致细胞生长速度的减缓。首先，SIRT1 在细胞生长和分裂中发挥着重要作用，SIRT1 的缺失可能会影响细胞正常的生长和分裂[13]。此外，SIRT1 在细胞代谢中也发挥了重要作用，缺失SIRT1 可能会影响细胞代谢水平，从而影响细胞的生长和增殖[14]。另外，SIRT1 还参与了多种信号转导通路的调控，如NF-κB、p53、AMPK等[15-16]，SIRT1 缺失可能会导致这些信号通路失去平衡，进而影响细胞的生长和增殖。此外，SIRT1 缺失可能会导致细胞凋亡增加，从而导致细胞生长缓慢。有研究发现，在白血病中，SIRT1 抑制了p53 介导的细胞凋亡，而缺失SIRT1 则可能导致p53 介导的细胞凋亡增加，从而影响细胞生长和增殖[4]。此外，SIRT1 还可以抑制ROS的产生和细胞氧化应激，缺失SIRT1 可能会导致ROS的产生增加，从而促进细胞凋亡[17]。

通过本研究的SIRT1 基因敲除模型，我们可以更深入地探究SIRT1 在白血病中的作用机制。例如，我们可以通过测定SIRT1 基因敲除细胞中的基因表达谱，分析SIRT1 对哪些基因表达起到调控作用，并且探究这些基因在白血病发生、发展中的作用。此外，我们还可以研究SIRT1 对白血病细胞增殖、存活、凋亡等生物学过程的影响，进一步探究SIRT1 在白血病中的作用机制。

尽管经过了尽量严谨的设计和实验，本文仍存在一些局限性。例如，近期报道Cas9 可能会影响p53 的水平[18]，而SIRT1 是p53 的互相调节分子。因此，本细胞系的p53 水平变化可能不仅仅由SIRT1 基因敲除导致，进一步构建无外源基因的SIRT1 基因敲除细胞是我们未来的研究方向。