基于网络药理学结合分子动力学模拟探究七气消聚散治疗肝硬化的作用机制

陈依虹，邹山扬，谭靖怡，杨亚军，3，陈 妹，吴郴凤，吴民华（.广东医科大学第一临床医学院，广东湛江 5403；.广东医科大学药学院，广东湛江 5403；3.广东天然药物研究与开发重点实验室，广东湛江 5403；4.广东医科大学基础医学院，广东湛江 5403）

肝硬化（cirrhosis）是常见的消化系统疾病，肝脏在各种病因的刺激下发生炎症，纤维组织持续增生，形成假小叶及再生结节，造成肝脏结构改变[1]。正常肝脏具有很强的再生能力，其再生潜力因炎症和纤维化积累而降低。持续的炎症和缺氧主要通过刺激病理性血管生成和血管重构促进肝脏纤维化进而发展为肝硬化[2-3]。肝硬化早期可通过干预获得一定程度的缓解，晚期只能通过肝移植来治愈[4]。抗纤维化以及抗炎等治疗有助于控制肝硬化的发展[2-3]。目前尚无高效且无明显不良反应的药物用于治疗肝硬化。中医治疗主要通过中药复方、中成药、单味药来发挥作用，在肝硬化治疗中表现出了明显优势[5]。中医辨证治疗多靶点、不良反应小的优点使其成为近年研究的热点[6]。

七气消聚散源于《杂病广要》，由香附、枳壳、三棱、青皮、莪术、木香、陈皮、厚朴、砂仁、甘草10 味药组成，主治因积聚相攻，或疼或胀初起者。积聚，中医指腹内积块，或胀或痛的一种病症，相当于西方医学中的肝脾肿大等，故七气消聚散可用于硬化治疗。中医治疗肝纤维化或肝硬化，采用的方法主要为清热祛湿、活血祛瘀、软坚散结、疏肝理脾、滋补肝肾[6]。香附主治胸腹胁肋胀痛、气郁不舒、气滞不通，青皮有疏肝破气、散结消痰的功效。七气消聚散中三棱有消积作用，能利水利湿、通经络，枳壳能消积、祛风湿、行气。

运用网络药理学、分子对接技术探究疾病与中医药间的联系是目前的研究热点[7]。本文以网络药理学结合分子对接和分子动力学模拟为基础，挖掘七气消聚散抗肝硬化的有效成分、作用靶点及潜在通路，为其后续研究和临床使用提供参考。

1 资料和方法

1.1 七气消聚散活性成分及靶点的收集

通过限制口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18 的条件，在TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中收集了七气消聚散中所有中药的活性成分及其对应的靶点蛋白。我们使用UniProt 数据库（https://www.uniprot.org/）将这些靶点蛋白转换为标准基因名。

1.2 肝硬化靶点整理

搜索关键词为“Cirrhosis”疾病靶点，在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）和DisGeNet（https://www.disgenet.org/search）数据库中进行。

1.3 交集靶点的筛选

使用R 软件将肝硬化和七气消聚散作用靶点取交集，输出Venn图，收集七气消聚散与肝硬化的共同靶点。

1.4 中药活性成分-靶点网络的构建

使用55 个共同靶点，推导出对应的活性成分和中药，并在Cytoscape_3.9.1 软件中建立活性成分-靶点网络。

1.5 蛋白互作网络（PPI）构建及核心靶点筛选

使用 STRING 数据库（https://string-db.org/），筛选物种为 Homo sapiens，筛选靶点置信度为 0.70 或以上的药物与疾病的共同靶点，建立 PPI 网络。在Cytoscape_3.9.1 中使用 CytoNCA 插件进行可视化分析。

1.6 基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

使用R 语言和Bioconductor 数据库中的“org.Hs.eg.db”“clusterProfiler”“DOSE”“enrichplot”和“stringi”，对肝硬化和七气消聚散的相交靶点进行GO 和KEGG 功能富集分析，设定P值和Q 值均为0.05。

1.7 GEO 数据集靶点验证

以“liver Cirrhosis”“LC”为关键词在GEO（生物技术信息基因表达综合数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）进行搜索，限定物种为“Homo sapiens”。将数据集编号为GSE77627 的数据下载，GSE77627共有 36 例样本，包括肝硬化患者样本22 例、对照组样本14 例。下载GSE77627 数据集的原始数据文件，含平台文件和序列探针矩阵文件。以平台注释文件为基础对探针进行注释，把探针矩阵转化为基因矩阵。利用R4.2.1 版本和相关软件包对数据来源进行标记，取PPI网络核心基因的基因矩阵，利用limma包计算基因表达差异的P值，得到核心基因的箱线图。

1.8 分子对接及分子动力学模拟

从 PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库得到活性成分的 2D 结构文件，然后使用 Chem3D 软件将其转换为最小自由能的 3D 空间构象的 .mol2 格式。前往 UniPort 数据库（https://www.uniprot.org/），将 Popular organisms 设定为 Human，找到与核心靶点对应蛋白的 PDB Entry，并在 PDB 数据库（http://www.rcsb.org/）中下载对应的 3D 晶体结构。使用 PyMol 软件和 AutoDockTools-1.5.7 软件对活性成分的 3D 空间构象和核心靶点对应蛋白的 3D 晶体结构做预处理，并使用 AutoDockTools-1.5.7 对核心靶点与七气消聚散主要活性成分槲皮素、异鼠李素、木犀草素、柚皮素等进行分子对接操作。最后，使用PyMOL 软件展示对接结果。

对接后，发现木犀草素与CCND1 结合最为稳定，使用分子动力学模拟CCND1 和木犀草素的复合物，测量其稳定性及灵活性。利用GROMACS2020.6 软 件包、charmm36 力场和TIP3P 水模型来做分子动力学模拟。为使该系统总电荷中性，加入对应数目的钠离子取代水分子得到合适大小的溶剂盒。进一步将周期边界条件（PBC）用在系统的3 个方向。利用 charmm 36 力场，从Sobtop[Tian Lu,Sobtop,Version 1.0（dev3）,http://sobereva.com/soft/Sobtop]得到木犀草素的力场参数。最开始，整个系统50 000 步的能量在310 k时被最小化（EM）。通过位置约束的MD模拟，以及通过NVT（粒子的数目、体积和温度恒定）和NPT（粒子的数目、压力和温度恒定），得到受体、配体和溶剂的平衡。通过对体系的均方根偏差（RMSD）和原子位置的均方根波动（RMSF）做分析，均方根偏差可以反映体系里的分散程度来表现复合物的稳定性，均方根波动可以反映某一个原子相对于参考构象的结构变化来表明原子的灵活性。

2 结果

2.1 七气消聚散活性化学成分和靶点筛选

在TCMSP数据库以OB≥30%、DL≥0.18 为条件筛选后得到青皮靶点110 个、三棱靶点140 个、香附靶点496 个、枳壳靶点123 个，经UniProt数据库进行ID转换后共得到靶点303 个。

2.2 肝硬化相关靶点及交集靶点的筛选

从 GeneCards 数据库（score=1）、OMIM、TTD、DrugBank 和 DisGeNet 数据库中收集肝硬化靶点基因，共得到 2 500 个基因（图1）。利用 venn 图与七气消聚散取交集，筛选得到 55 个共同靶点基因（图2）。

图1 5 个疾病数据库的肝硬化基因

图2 七气消聚散-肝硬化靶点基因匹配情况

2.3 药物-活性成分-疾病靶点网络构建和关键活性成分分析

在Cytoscape_3.9.1 软件中，利用55 个共同的靶点构建了活性成分和疾病靶点网络（图3）。

图3 七气消聚散关键活性成分-肝硬化靶点网络图

左侧圆形节点表示活性成分，圆形节点的不同颜色代表不同活性成分，三棱为黄色、青皮为青色、香附为香芋紫、枳壳为红色；右侧蓝色方形节点表示潜在作用靶点。

2.4 PPI 网络的构建及核心靶点的筛选

运用 STRING 数据库，选择“high confidence：0.70”模式下对 55 个药物-疾病交集靶点构建蛋白互作网络（图4），得到55 个节点，145 条边，平均节点度值 5.27。通过 Cytoscape_3.9.1 软件分析中心性（DC）、介度中心性（BC）、特征向量中心性（EC）、紧密中心性（CC）、网络中心性（NC）和基于局部平均连通性的方法（LAC）拓扑参数，以大于中位值的基因为筛选条件，第一次筛选得到45 个基因，第二次筛选得到15 个基因，其中核心基因为4 个，分别为MYC、CCND1、RELA和TP53（图5）。

图4 交集基因的蛋白互作网络

图5 七气消聚散-肝硬化的核心靶点

2.5 GO功能富集分析

GO 分析结果（图6）显示七气消聚散方治疗肝硬化主要涉及肽应答和细胞因子介导的信号通路等生物过程（biological process,BP），涉及的细胞组成（cellular component,CC）包括转录调节复合物、质膜外侧面，影响的分子功能（molecular function,MF）主要集中在DNA 结合转录因子结合、RNA 聚合酶 II 特异性 DNA结合转录因子结合等方面。

图6 七气消聚散作用靶点 GO 生物学过程富集分析

2.6 KEGG富集分析

KEGG 富集分析显示前30 条通路（P＜0.05，图7），主要涉及乙型/丙型肝炎及P53、PI3K/AKT信号通路。上述途径可能与七气消聚散干预肝硬化的发生发展有关。

图7 七气消聚散作用靶点 KEGG富集分析

2.7 利用基因芯片进行核心基因的表达分析

下载GSE77627 数据集，经过筛选得到正常肝组织和肝硬化组织的差异表达基因，差异基因与核心基因取交集，图8 显示七气消聚散的4 个核心靶点在癌和癌旁间的表达具有差异，其中CCND1 及RELA的表达差异最为显著（P值均＜0.001），CCND1 和RELA可能为七气消聚散治疗肝硬化的潜在关键靶基因。

图8 GEO芯片核心靶基因箱线图

2.8 分子对接验证及分子动力学分析

将肝硬化核心靶点蛋白（MYC、RELA、CCND1、TP53）与七气消聚散主要活性成分槲皮素、异鼠李素、山奈酚、木犀草素、柚皮素、川陈皮素进行分子对接。

结果显示最低结合自由能皆低于0 kCal/mol。其中，木犀草素与靶点蛋白CCND1（图9A）、槲皮素与靶点蛋白CCND1（图9B）、柚皮素与靶点蛋白RELA（图9C）的结合稳定，分别为-7.38、-7.10、-6.81 kCal/mol，最低结合自由能皆低于-5 kCal/mol。分子对接结果用pymol 可视化后见图9。进一步使用分子动力学技术模拟木犀草素与 CCND1 复合物的稳定性和灵活性，获得CCND1 和木犀草素在蛋白质上RMSD 和RMSF的结果。发现和首帧比较，CCND1 与木犀草素在时间为80 ns的模拟中，在 12 ns达到平衡，表明CCND1 和木犀草素的体系迅速到达稳定状态以及未出现过多的波动（图10A）。RMSF 的值位于0.1～1.20 nm 的范围内（图10B），其中残基GLY160 的RMSF值是0.1 nm，表示氢键发挥限制GLY160 的效果。

图9 分子对接结果可视化图

图10 分子动力学模拟木犀草素-CCND1 活性位点的结合模式

3 讨论

3.1 肝硬化治疗现状

肝硬化目前是全球第11 大最常见的死亡原因[8]。肝硬化分为代偿期和失代偿期，代偿期肝硬化的治疗目标是减缓、停止或逆转纤维化进展为失代偿期，而失代偿期肝硬化的重点是防止进一步失代偿和死亡。

肝硬化与肝纤维化关系紧密，肝纤维化如果未得到及时治疗或控制，会逐渐发展成为肝硬化，早期发现和阻断肝纤维化被认为是治疗肝硬化的重要方法之一。有多种途径会促进纤维化的发生，如肝细胞的凋亡与坏死、肝星状细胞（HSC）活化、巨噬细胞、淋巴细胞的募集[8]。其中HSC活化是肝纤维化的中心环节[9]，抗HSC及抑制巨噬细胞是抗肝纤维化/肝硬化的重要方法。在现代医学尚无有效抗肝纤维化、肝硬化药物的困境下[10]，中医药特有的理论及防治经验，在改善临床症状、阻止及逆转肝纤维化、预防及治疗并发症方面有独特优势，中医药辨治肝硬化发展前景良好[11]。中医药多成分、多靶点、多通路特点或许是治疗肝硬化的突破点[12]。

3.2 七气消聚散及其有效成分抗肝硬化作用

肝硬化的治疗策略主要包括抑制肝脏炎症反应、促进肝细胞再生、改善肝脏代谢异常以及阻止肝纤维化进展4 个方面。香附的功效是治疗肝郁气滞，在七气消聚散中以香附作为君药治疗肝硬化。香附多糖已被证实能有效缓解机体炎症反应、改善氧化应激，并在动物实验中可有效改善大鼠肝脏纤维化程度[13]。莪术的主要活性成分莪术醇已被证实抑制 TGF-β1/Smad信号通路的活动来发挥抗肝纤维化的作用机制[14]。在三棱莪术颗粒联合西药治疗肝硬化腹水的研究中，三棱-莪术的联合使用减少腹水及肝损伤，通过化瘀、破气消积聚等功效有效改善肝硬化患者的预后[15]。

七气消聚散的有效成分包括柚皮素、槲皮素、异鼠李素、山奈酚、木犀草素、川陈皮素等。在抗肝纤维化上，槲皮素通过影响TGF-β1/Smads 和PI3K/Akt 通路来减少自噬[16]，山奈酚则通过抑制Jag1 水平[17]，两者皆通过抑制肝星状细胞活化来发挥作用。在抗炎和抑制氧化应激上，槲皮素也发挥着重要作用，通过降低肝脏脂质积累来改善代谢紊乱[18]。在降低机体炎症反应上，柚皮素通过下调肝巨噬细胞和肝细胞中的NLRP3/NF-κB 信号通路减弱了炎症对小鼠下肝脏的刺激[19]，木犀草素除可抑制NF-κB通路外[20]，还通过抑制AKT/mTOR/ p70S6K 和TGF-β/Smad 信号通路减轻肝纤维化[21]。在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）小鼠模型中，异鼠李素可改善脂肪变性、抑制肝胶原沉积和减少肝细胞凋亡[22]。川陈皮素在喂食高脂饮食的小鼠中，表现出抑制肝脂肪变性和血脂代谢异常的作用[23]。本研究发现，柚皮素、槲皮素及木犀草素与CCND1和RELA 靶点的结合稳定。我们推测七气消聚散对NF-κB 信号通路的关键转录因子RelA（p65）进行调控[24]，通过抑制炎症阻止肝硬化的进行性加重，并可通过CCND1 调节细胞 G1/S 期的转换来促进肝细胞的再生[25]来保护肝功能。

3.3 研究结果和研究价值分析

网络药理学通过建立药物-靶点-通路等多层网络，可以快速准确地预测药物作用的目标和机制，我们通过建立七气消聚散有效成分与肝硬化疾病的共同靶点，挖掘出七气消聚散可能通过肝硬化疾病网络核心靶点MYC、TP53、CCND1、RELA 发挥抗肝硬化的效果。在筛选过程中发现，柚皮素、槲皮素、木犀草素与核心基因CCND1 及RELA的分子对接中结合能低，成键稳定。其中木犀草素与CCND1 的结合最稳定。

分子动力学模拟是一种计算模拟方法，用于研究分子的运动、结构和相互作用，可以获取原子的运动轨迹，还可以观察到原子运动过程中各种微观细节[26]。本研究利用分子动力系模拟对木犀草素与CCND1 的结合进行更深入的研究，结果显示木犀草素与CCND1 具有良好的结合能力，提示木犀草素可调控细胞周期。

通过分析GEO芯片结果，我们发现核心靶点基因CCND1、RELA等在正常组织和肝硬化组织间存在表达差异，这提示七气消聚散可能通过其有效成分影响核心靶点基因发挥抗肝硬化的功效，这些核心靶点基因在肝硬化中发挥的作用值得进行深入研究。研究表明，PI3K/Akt 和P53 通路通过对细胞外基质（ECM）降解的作用影响HSC增殖和HSC凋亡，从而影响肝纤维化的发生和进展[27-28]。本研究KEGG 富集分析表明七气消聚散可调节PI3K/AKT、P53 信号通路，七气消聚散可能通过影响这些通路治疗肝硬化。

本研究以七气消聚散治疗积聚为基础，借助网络药理学、分子对接、分子动力学模拟及生物信息学分析，结果提示七气消聚散可通过抗炎、影响细胞凋亡发挥抗肝硬化的作用。本研究为七气消聚散治疗肝硬化的实验和临床研究提供了理论依据。