调控miR-642a-5p表达对宫颈癌HeLa细胞生物学行为的影响及机制研究

袁浩鑫,冯一平,王思雨,曾尚云

(大同市第五人民医院,山西 大同 037009)

宫颈癌是成年女性常见的生殖道恶性肿瘤,2020年全球最新癌症负担数据显示,未来10年我国宫颈癌死亡人数预计上升25%[1]。手术切除、辅助放化疗是目前临床治疗宫颈癌的主要手段,但术后易复发,病死率较高[2-3]。目前已知人类乳头瘤病毒持续感染是导致宫颈癌发生的主要原因,但随着对宫颈癌发病机制的深入研究,越来越多的证据表明,宫颈癌的发生发展与相关基因表达水平的改变密切相关,其中微小RNA(miRNA,miR)通过转录后调控机制靶向调控基因的表达,参与宫颈癌的病理进程[4-5]。近年来研究发现,miR-642a-5p是一种肿瘤抑制因子,上调miR-642a-5p表达可抑制某些恶性肿瘤如结肠癌、前列腺癌细胞的迁移与侵袭[6-7]。且有临床报道显示,宫颈癌组织miR-642a-5p与人类乳头瘤病毒阳性宫颈癌根治术术后复发相关[8]。但miR-642a-5p对于宫颈癌生物学特征的影响机制尚不清楚。本研究探究miR-642a-5p对宫颈癌细胞恶性进展的调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 HeLa细胞株由中国科学院上海细胞库提供(货号CL-0087)。

1.2 试剂与仪器 RPMI1640培养基、Trizol试剂、RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR测定试剂盒、AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、MTT检测试剂盒(货号ml017538、ml095476、ml095837、ml078226、ml078535-R、ml095225、ml057897)购于上海酶联生物科技有限公司;Lipofectamine 2000试剂(货号15596018)购自美国Invitogen公司;细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒、β-actin抗体(货号P0013、P0011、P0018M、AG2737、AN365、AF2815)购自上海碧云天生物科技有限公司;NF-κBp65抗体(货号YT828-CQR)购自北京百奥莱博科技有限公司;miR-642a-5p mimic、miR-642a-5p mimic NC购自上海吉玛制药技术有限公司;其余试剂均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。细胞培养皿等试验耗材购于杭州欣友生物技术有限公司;MG80二氧化碳细胞培养箱购于上海冠森生物科技有限公司;Transwell小室购自美国Coring公司;Accuri C6流式细胞分析仪购于美国BD公司;Axio Observer倒置显微镜购于德国Carl Zeiss公司;abi7500荧光定量PCR仪购于美国Abi公司;Western blot电泳仪器购于美国Bio-Rad公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养及转染:在RPMI1640培养基中(含有胎牛血清、青霉素和链霉素)常规接种人宫颈癌HeLa细胞,于培养箱中培养至细胞密度为80%～90%,消化传代后取对数生长期的细胞接种于6孔板中,2×105个/孔,继续培养,转染miR-642a-5p mimic、miR-642a-5p mimic NC,将细胞分为对照组、miR-642a-5p mimic组、miR-642a-5p mimic NC组,各组HeLa细胞置37 ℃培养箱继续培养48 h后,进行后续实验操作。所有实验均独立重复3次。

1.3.2 RT-qPCR法检测miR-642a-5p mRNA表达水平:收集各组转染后的HeLa细胞,Trizol处理提取总RNA并逆转录成cDNA。进行RT-qPCR实验,反应程序:95 ℃、3 min,95 ℃、15 s,56 ℃、30 s,72 ℃、10 s,共40个循环。以U6为内参,计算miR-642a-5p的表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.3.3 Western blot法:收集各组转染后的HeLa细胞,裂解提取细胞总蛋白并测定浓度。取蛋白样品进行电泳,转膜90 min,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,TBST漂洗10 min×3次,分别加入NF-κB p65一抗(1∶500)、β-actin一抗(1∶500),TBST漂洗10 min×3次,加HRP标记的二抗(1∶200),室温下孵育1 h,TBST洗膜10 min×3次,以ECL试剂显影,用凝胶成像分析系统进行扫描,采用Image J软件分析目的蛋白条带灰度值。

1.3.4 MTT法:各组HeLa细胞重悬后接种于96孔培养板,每孔1×103～1×104个细胞,置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。严格按照MTT检测试剂盒操作说明进行实验。每孔加入50 μl的MTT液(2 g/L),继续培养3 h,吸出孔内培养液,加入DMSO液,于570 nm波长处检测,计算细胞存活率。

1.3.5 Transwell法:调整各组细胞密度,Transwell小室的上室预先用Matrigel胶包被,加入细胞悬液和完全培养基,培养箱培养48 h,擦去多余细胞,做好标记,乙醇固定,PBS清洗,结晶紫染色液染色,弃掉多余染色液,加入调色液A、B,温和混匀,PBS清洗。在显微镜下观察并记录细胞数。在HeLa细胞迁移实验中,将HeLa细胞接种于不铺Matrigel胶的上室,其余步骤同侵袭实验。

1.3.6 流式细胞术:用预冷的PBS洗涤转染48 h后的各组HeLa细胞,离心重悬,调整浓度为1×106个/ml,加入Annexin V-FITC、PI染色液、PBS,上机检测细胞凋亡情况。

2 结 果

2.1 各组细胞中miR-642a-5p、NF-κB mRNA表达水平比较 miR-642a-5p mimic组miR-642a-5p mRNA表达水平高于对照组和miR-642a-5p mimic NC组,NF-κB mRNA的表达水平低于对照组和miR-642a-5p mimic NC组(均P<0.05);对照组与miR-642a-5p mimic NC组miR-642a-5p、NF-κB mRNA的表达水平比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。见表2。

表2 各组细胞中miR-642a-5p、NF-κB mRNA表达水平比较

2.2 各组细胞中NF-κB p65蛋白表达水平比较 对照组、miR-642a-5p mimic NC组、miR-642a-5p mimic组细胞中NF-κB p65蛋白的表达水平分别为(0.93±0.10)、(0.91±0.13)、(0.69±0.07),三组NF-κB p65蛋白的表达水平差异有统计学意义(均P<0.05);miR-642a-5p mimic组NF-κB p65蛋白的表达水平低于对照组和miR-642a-5p mimic NC组(均P<0.05);对照组与miR-642a-5p mimic NC组NF-κB p65蛋白的表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组HeLa细胞转染不同时间存活率比较 转染0 h,对照组、miR-642a-5p mimic NC组、miR-642a-5p mimic组细胞增殖活性比较,差异无统计学意义(均P>0.05);转染24、48 h,miR-642a-5p mimic组细胞增殖活性低于对照组和miR-642a-5p mimic NC组(均P<0.05);转染24、48 h,对照组和miR-642a-5p mimic NC组细胞增殖活性比较,差异无统计学意义(均P>0.05);对照组、miR-642a-5p mimic NC组细胞增殖活性呈时间依赖性升高,miR-642a-5p mimic组细胞增殖活性呈时间依赖性下降(均P<0.05)。见表3。

2.4 各组HeLa细胞迁移、侵袭情况比较 对照组、miR-642a-5p mimic NC组、miR-642a-5p mimic组侵袭细胞个数、划痕愈合率比较有统计学差异(均P<0.05);miR-642a-5p mimic组侵袭细胞个数、划痕愈合率低于对照组和miR-642a-5p mimic NC组,差异有统计学意义(均P<0.05);对照组与miR-642a-5p mimic NC组侵袭细胞个数、划痕愈合率比较无统计学差异(均P>0.05)。见表4。

表4 各组HeLa细胞迁移、侵袭情况比较

2.5 各组Hela细胞凋亡情况比较 对照组、miR-642a-5p mimic NC组、miR-642a-5p mimic组细胞凋亡率分别为(11.20±1.63)、(12.01±1.35)、(28.04±3.62),三组细胞凋亡率比较差异有统计学意义(均P<0.05);miR-642a-5p mimic组细胞凋亡率高于对照组和miR-642a-5p mimic NC组(均P<0.05);对照组与miR-642a-5p mimic NC组细胞凋亡率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

近年来越来越多的研究证实,在恶性肿瘤的发生发展、侵袭转移和细胞凋亡等病理过程中均有miRNA的参与,同一种miRNA可能在不同癌症中或不同miRNA可能在同一癌症中发挥癌基因或者抑癌基因的作用[9-11]。在众多与肿瘤相关的miRNA中,miR-642a-5p已经被发现在人类多种肿瘤中发挥抑癌基因的作用[12]。如Wang等[13]研究表明,miR-642a-5p通过靶向Ⅰ型胶原α1抑制结肠癌细胞的迁移和侵袭。郝帅等[14]研究认为,上调miR-642a-5p表达可通过抑制核受体NF-κB信号通路,降低蛋白磷酸化水平,抑制非小细胞肺癌LTEP-a2细胞的增殖迁移能力。然而关于miR-642a-5p在宫颈癌中的作用机制研究较少。Liu等[15]报道显示,宫颈癌细胞中miR-642a-5p表达降低。但关于miR-642a-5p对宫颈癌细胞恶性生物学行为影响尚不清楚。因此,本研究试探讨上调miR-642a-5p表达对于HeLa细胞增殖和分化的影响。本研究结果显示,miR-642a-5p mimic组细胞存活率、侵袭细胞个数、划痕愈合率均低于对照组、miR-642a-5p mimic NC组,细胞凋亡率高于对照组、miR-642a-5p mimic NC组,提示上调miR-642a-5p表达可抑制宫颈癌HeLa细胞的恶性进展,但具体影响机制仍有待进一步研究。

NF-κB信号通路在免疫系统中具有重要作用,其参与细胞的增殖、分化以及凋亡等生理过程[16]。在正常情况下,存在于胞浆中的NF-κB复合物为非活性形式,不具备调节基因转录的能力,但当细胞受到细菌或病毒感染、炎症细胞因子、电离辐射等外界因素刺激时,NF-κB/IκB复合物解离,NF-κB信号通路被激活,进而对相关基因发挥调控作用[17-18]。研究发现,NF-κB信号通路参与人乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌等多种肿瘤的病理进程,癌细胞中不同类型的分子改变可能会激活NF-κB信号通路,使其下游基因表达异常,从而促进疾病的发生发展[19-21]。目前临床研究和基础实验均发现NF-κB p65在宫颈癌组织和细胞系中均呈现高表达,主要发挥抗肿瘤细胞凋亡和保护肿瘤细胞的作用[22-23]。本研究发现,在宫颈癌HeLa细胞中,miR-642a-5p mimic组NF-κB mRNA和NF-κB p65蛋白的表达量均高于对照组、miR-642a-5p mimic NC组,提示过表达miR-642a-5p可能通过调控NF-κB抑制NF-κB p65蛋白表达,阻断细胞周期,诱导其凋亡。既往研究显示,针对NF-κB的靶向治疗可能抑制肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤等多种癌症的进展[24],但在宫颈癌治疗方面仍需临床验证。结合本研究,未来可基于miR-642a-5p开发针对NF-κB的靶向治疗药物,为宫颈癌的扩散转移提供新的预防治疗手段。

综上所述,上调miR-642a-5p表达可在一定程度上阻断宫颈癌细胞恶性进展,这可能与NF-κB信号通路被抑制有关。然而,本研究仅为单一细胞系的体外研究,并未对其他宫颈癌细胞系的miR-642a-5p表达情况及相关机制进行探究,后续仍需深入探索。