岩黄连总碱下调miR-223表达调控人牙龈成纤维细胞增殖与凋亡的分子机制研究

谢陆莉,李 鲲,邓 琳

(成都市龙泉驿区第一人民医院口腔科,四川 成都 610100)

牙周炎是一种高发的感染性疾病,以牙龈炎症、牙槽骨吸收和牙齿松动甚至脱落为特征[1-2];细菌感染牙龈介导的炎症细胞因子的释放是牙周炎牙齿脱落的主要原因之一[3-5]。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)是牙周炎的主要致病菌,脂多糖(Lipopolysacharide,LPS)是主要作用因子,其可破坏牙周组织细胞进而促进牙周炎发展进程[6-7]。因而抑制牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,Pg-LPS)的毒性作用是缓解牙周炎的重要途径。岩黄连总碱是岩黄连的主要有效成分,具有抗炎、抗菌和抗氧化等作用[8]。研究[9]显示,岩黄连总碱在体外可抑制Pg的生长,但岩黄连总碱对牙周炎的影响尚未阐明。miR-223是牙周炎组织中表达较高的微小RNA(microRNA,miRNA)之一,与牙周炎患者的血清和龈沟液中炎症介质水平升高有关[10-11]。据报道,miR-223高表达可促进炎性反应,加重人牙龈成纤维细胞损伤[12]。磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)信号通路是miR-223发挥炎症调节剂作用的通路之一[13]。研究[14]显示,miR-223可通过激活PI3K/AKT通路引发溃疡性结肠炎大鼠细胞凋亡和炎性反应。抑制PI3K/AKT通路的激活可减轻LPS诱导的人牙龈成纤维细胞的炎性反应[15],并可抑制牙周炎大鼠牙槽骨的丢失[16]。因此,本研究采用Pg-LPS诱导人牙龈成纤维细胞建立细胞炎症模型,探讨岩黄连总碱对Pg-LPS诱导人牙龈成纤维细胞增殖、凋亡和炎性反应的影响及其对miR-223/PI3K/AKT信号通路的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 岩黄连总碱(纯度≥98%,上海西格生物科技有限公司);Pg-LPS(上海研卉生物);Lipofectamine2000(美国Thermo Fisher);人牙龈成纤维细胞(武汉普诺赛生命科技有限公司);miR-223 mimics、miR-NC、anti-miR-223、anti-miR-NC(广州锐博生物);MTT试剂与凋亡检测试剂盒(北京索莱宝);白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(上海酶联);兔抗人pro-caspase-3、Cleaved-caspase-3(美国Santa Cruz);兔抗人PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT抗体(美国CST)。

1.2 实验方法

1.2.1 岩黄连总碱对人牙龈成纤维细胞的细胞毒性作用:人牙龈成纤维细胞以每孔2×104个细胞接种于96孔板中,使用终浓度为5、10、20、40、80、160 μg/ml的岩黄连总碱处理24 h,每孔加入20 μl的MTT溶液(PBS缓冲液制成5 mg/ml溶液),37 ℃避光孵育4 h,再加入150 μl DMSO溶液,检测酶标仪490 nm处吸光度值(A490 nm),计算细胞增殖活力(%)。

1.2.2 实验分组:人牙龈成纤维细胞按照每孔1×104个接种于6孔板后分为对照组(NC组,未经处理的人牙龈成纤维细胞)、Pg-LPS组(加入100 μg/ml的Pg-LPS处理24 h)、5 μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS组、10 μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS组和20 μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS组(分别添加含有5、10、20 μg/ml岩黄连总碱与100 μg/ml Pg-LPS共同处理人牙龈成纤维细胞24 h),miR-NC+Pg-LPS组、miR-223+Pg-LPS组、anti-miR-NC+Pg-LPS组和anti-miR-223+Pg-LPS组(miR-NC、miR-223 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-223分别转染至人牙龈成纤维细胞后加入100 μg/ml的Pg-LPS处理24 h),20 μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS+miR-NC组和20 μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS+miR-223组(miR-NC、miR-223 mimics分别转染至人牙龈成纤维细胞后加入20 μg/ml岩黄连总碱与100 μg/ml Pg-LPS共同处理人牙龈成纤维细胞24 h)。

1.2.3 EDU检测细胞增殖:将各组人牙龈成纤维细胞(1×106个/ml)接种于12孔板(200 μl/孔),加入EDU工作液(20 μmol/L)孵育2 h,用4%固定液固定15 min后,加入1 ml 0.3% Triton X-100,加入DAPI染色液孵育30 min,荧光显微镜下观察,蓝色为细胞核,绿色为EDU阳性细胞(增殖细胞),计算EDU染色阳性率(EDU阳性细胞数/DAPI染色总细胞数×100%)。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率:收集各组人牙龈成纤维细胞并用500 μl Binding buffer重悬,分别加入Annexin V-FITC(5 μl)与PI(5 μl),室温避光孵育10 min,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5 RT-qPCR检测miR-223的表达水平:采用Trizol法提取细胞总RNA,反转录合成cDNA后进行RT-qPCR扩增。应用ABI Step One Plus荧光定量PCR仪检测miR-223相对表达量。引物序列:miR-223正向5’-CGGACGTGTATTTGACAAGC-3’和反向5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3’;U6正向5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’和反向5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。

1.2.6 ELISA法测定炎症因子IL-1β、TNF-α表达水平:将各组细胞培养上清液离心(1000 g、10 min),取上清液,ELISA试剂盒检测IL-1β、TNF-α表达水平。

1.2.7 Western blot检测Cleaved-caspase-3、pro-caspase-3和PI3K/AKT通路相关蛋白表达水平:RIPA裂解液提取细胞总蛋白,蛋白变性后进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,转膜、封闭2 h,孵育pro-caspase-3(1∶1000)、Cleaved-caspase-3(1∶800)、PI3K(1∶1000)、p-PI3K(1∶1000)、AKT(1∶1000)、p-AKT(1∶1000)一抗与β-actin抗体稀释液(1∶1000),4 ℃孵育过夜,加入二抗稀释液(1∶2000),室温孵育1 h后加入电化学发光试剂显影,用Image J软件分析各条带灰度值。

2 结 果

2.1 岩黄连总碱对人牙龈成纤维细胞的毒性作用 与0 μg/ml组比较,使用5、10、20、40 μg/ml的岩黄连总碱处理人牙龈成纤维细胞24 h后,细胞增殖活力无显著变化(均P>0.05),而80、160 μg/ml岩黄连总碱可显著降低人牙龈成纤维细胞的增殖活力(均P<0.05),见图1。因此,选择5、10、20 μg/ml的岩黄连总碱进行后续实验。

注:与0 μg/ml组比较,*P<0.05图1 岩黄连总碱对人牙龈成纤维细胞增殖的影响

2.2 岩黄连总碱对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞增殖、凋亡和炎性因子水平的影响 与NC组比较,Pg-LPS组细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及IL-1β、TNF-α水平升高,EDU阳性细胞数减少(均P<0.05);与Pg-LPS组比较,5 μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS组、10 μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS组、20 μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS组细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及IL-1β、TNF-α水平降低,EDU阳性细胞数增多(均P<0.05),不同剂量岩黄连总碱组间各指标比较差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

表1 岩黄连总碱对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞增殖、凋亡与炎性因子水平的影响

2.3 岩黄连总碱对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞中miR-223表达和PI3K/AKT通路的影响 与NC组比较,Pg-LPS组miR-223的表达量、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高(均P<0.05);与Pg-LPS组比较,5 μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS组、10 μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS组、20 μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS组miR-223的表达量、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值降低(均P<0.05),不同剂量岩黄连总碱组间各指标比较差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 岩黄连总碱对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞中miR-223表达和PI3K/AKT通路的影响

2.4 miR-223对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞增殖、凋亡和炎性因子水平的影响 与miR-NC+Pg-LPS组比较,miR-223+Pg-LPS组细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及IL-1β、TNF-α水平升高,EDU阳性细胞数减少(均P<0.05);与anti-miR-NC+Pg-LPS组比较,anti-miR-223+Pg-LPS组细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及IL-1β、TNF-α水平降低,EDU阳性细胞数增多(均P<0.05)。见表3。

表3 miR-223对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞增殖、凋亡和炎性因子水平的影响

2.5 miR-223对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞中PI3K/AKT通路的影响 与miR-NC+Pg-LPS组比较,miR-223+Pg-LPS组p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高(均P<0.05);与anti-miR-NC+Pg-LPS组比较,anti-miR-223+Pg-LPS组p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值降低(均P<0.05)。见表4。

表4 miR-223对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞中PI3K/AKT通路的影响

2.6 miR-223可以逆转岩黄连总碱对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞增殖、凋亡和炎性因子水平 与20 μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS+miR-NC组比较,20 μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS+miR-223组细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及IL-1β、TNF-α水平升高,EDU阳性细胞数减少(均P<0.05)。见表5。

表5 miR-223可以逆转岩黄连总碱对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞增殖、凋亡和炎性因子水平

2.7 miR-223可以逆转岩黄连总碱对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞中PI3K/AKT通路相关蛋白表达 与20 μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS+miR-NC组比较,20 μg/ml岩黄连总碱+Pg-LPS+miR-223组p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高(均P<0.05),见表6。

表6 miR-223可以逆转岩黄连总碱对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞中PI3K/AKT通路相关蛋白表达

3 讨 论

牙龈成纤维细胞是牙周组织的主要细胞成分,参与牙周炎的发生发展过程。研究显示,与健康人相比,慢性牙周炎患者牙龈成纤维细胞活性降低,细胞凋亡增加[17]。LPS是Pg外膜的重要毒力因子,可诱导人牙龈成纤维细胞产生IL-1β、TNF-α等炎性因子,促进炎性反应,加重牙周炎[7]。本研究发现,Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞活力降低,细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高,而岩黄连总碱作用后Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞活力升高,细胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平降低,提示岩黄连总碱可促进Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞增殖,抑制细胞凋亡。此外,岩黄连总碱可降低Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞中IL-1β、TNF-α水平,提示岩黄连总碱可抑制Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞炎性反应。

miR-223参与感染、免疫反应和多种炎症性疾病的调节。已有研究证明,与健康牙龈相比,牙周炎患者牙龈组织中miR-223上调[18]。在牙周炎大鼠模型的血清中也发现了miR-223的上调表达[19]。此外,据报道,miR-223是牙周炎患者血清和龈沟液中过表达的miRNA之一[11]。miR-223通过靶向NLRP3促进LPS诱导人类牙髓成纤维细胞的炎性反应[20]。本研究发现Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞中miR-223的表达量升高,抑制miR-223表达后Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞活力升高,凋亡能力和IL-1β、TNF-α水平降低,而过表达miR-223表现出相反作用,提示miR-223过表达可能促进牙周炎的发生。在本研究中,岩黄连总碱可降低Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞中miR-223的表达,且过表达miR-223可拮抗岩黄连总碱对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞增殖及凋亡的作用,提示岩黄连总碱可能通过调控miR-223的表达而对Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞发挥保护作用。

此外,本研究发现,岩黄连总碱可抑制Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞中PI3K/AKT通路的激活。PI3K/AKT信号通路在牙周炎中被激活,可导致核因子-κB(Nuclear factor κB,NF-κB)活化,促进牙周炎的发生及发展[21-22]。Jiang等[14]发现,miR-223可通过激活PI3K/AKT信号通路促进溃疡性结肠炎大鼠细胞凋亡和炎性反应。本研究发现Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞中p-PI3K、p-AKT蛋白水平升高,岩黄连总碱处理或抑制miR-223表达后p-PI3K、p-AKT蛋白水平降低,而过表达miR-223可降低岩黄连总碱对p-PI3K、p-AKT蛋白表达的抑制作用,提示岩黄连总碱可能通过下调miR-223表达,抑制PI3K/AKT通路的活化,进而抑制牙周炎的发生。

综上所述,岩黄连总碱可促进Pg-LPS诱导的人牙龈成纤维细胞增殖,抑制细胞凋亡和炎性反应,可能是通过下调miR-223抑制PI3K/AKT信号通路实现的。由于miR-223基因序列上包含多个调控位点,岩黄连总碱通过何种途径调控miR-223表达以及miR-223下游靶基因仍需进一步探究。