蚯蚓对新烟碱类杀虫剂吡虫啉、啶虫脒污染红壤中细菌群落结构的影响

王娇娇　武春媛　谭华东　李怡

关键词：蚯蚓；细菌群落；吡虫啉；啶虫脒；红壤；环境因子

中图分类号：X53 文献标识码：A

新烟碱类杀虫剂（neonicotinoids， NEOs）是在烟碱结构基础上开发出来的一类新型杀虫剂，也是目前世界上应用最广泛的杀虫剂之一[1]，广泛应用于农业、景观、动物领域的害虫防治，主要包括吡虫啉（ imidacloprid， IMI ）、啶虫脒（acetamiprid， ACE）、噻虫胺（clothianidin， CLO）、噻虫啉（thiacloprid， THD）、噻虫嗪（thiamethoxam，THM）、烯啶虫胺（nitenpyram， NIT）和呋虫胺（dinotefuran， DIN）等[2]。NEOs 是烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor， nAChR）的激动剂，主要通过选择性控制昆虫神经系统中烟碱型乙酰胆碱酯酶受体，阻断昆虫中枢神经系统的正常传导，达到杀虫目的[3]。NEOs 具有水溶性和持久性，在土壤当中的半衰期从几十到几百天不等；其较高的淋溶和径流潜力，能在土壤中连续积累并随地表径流或渗透进入地表水和地下水[4]，世界上大多河流水体中都可监测到新烟碱类杀虫剂残留[5]。其频繁使用可在土壤、水体中累积毒性，使NEOs 在土壤、水体和生物中成为一个持续存在的环境问题[6-7]。多项研究发现，NEOs 残留会对非靶标有益生物蜜蜂、鸟类、蚯蚓等构成伤害[8-10]；水体中的NEOs 残留会对鱼类、蝌蚪等水生生物造成不同程度的损伤[11-13]，除此之外，NEOs 可通过食物链致使人体中枢神经系统紊乱，严重会导致呼吸系统和心血管系统损伤，甚至死亡[14]。鉴于NEOs 的危害，作为欧盟农业大国，法国已于2018 年开始全面禁止NEOs 用于植物虫害防控[15]。

常见农田土壤污染修复技术主要为生物修复[16]。目前，生物修复的研究大多集中于微生物修复和植物修复，利用动物修复土壤的研究相对较少[17]。蚯蚓作为生物量最大的土壤动物，对土壤生态系统和环境质量影响深远[4]。蚯蚓吸食污染物后，其作穴、排泄等行为可促进微生物活性、提高有益微生物数量，从而改变土壤养分转化情况[18]；土壤微生物的群落结构及其平衡对土壤有重要的影响。而细菌作为微生物中含量最多、丰度最高的类群，能够参与土壤中多数养分的转化，在能量流动和信息传递上发挥着重要功能，因此常被认为是土壤生态系统质量变化的早期指标[19]。

南方红壤区人口稠密，人均耕地面积少，农田开发强度大[20]；IMI、ACE 是使用较广的2 种NEOs，它们普遍残留在土壤和水体环境中；目前，已经有越来越多的研究关注到NEOs 在土壤当中的环境行为，但较少有关蚯蚓作用于IMI、ACE污染红壤的修复机制研究。本研究以赤子爱胜蚯蚓（Eisenia foetida）为土壤修复动物，选取IMI、ACE 两种常用新烟碱类杀虫剂，利用16S rRNA高通量测序、冗余分析（RDA）等方法，研究蚯蚓对NEOs 污染红壤的理化性质及细菌群落结构的影响，探究潜在的降解微生物类群及蚯蚓对农田红壤NEOs 的去除能力，为NEOs 污染农田红壤修复提供科学依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

试验土壤采自海南省澄迈县（110°2′25″E，19°44′5″N）无吡虫啉、啶虫脒污染的土地。采集0～20 cm 深度土样，自然风干后，研磨过20 目尼龙筛，经测定，土壤基本理化性质为：pH 为6.14，土壤有机质（SOM） 25.41 g/kg，全氮（TN）1.21 g/kg，全磷（TP） 1.32 g/kg，全钾（TK）1.38 g/kg。供试蚯蚓品种为赤子爱胜蚓（Eiseniafoetida），来自中国热带农业科学院热带生态农业基地。试验前，选择健康、具有相似长度和体重，且有环带的成熟蚯蚓[21]，用无菌水清洗，并置于湿滤纸上，25 ℃，黑暗中清肠48 h，在试验土壤中适应2 周。吡虫啉和啶虫脒为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 在开展试验前，了解蚯蚓在不同浓度吡虫啉、啶虫脒污染红壤中的存活情况。分别在农药浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0 mg/kg 的试验红壤中加入蚯蚓，进行为期30 d的预试验，每日观察记录蚯蚓的存活情况。预试验结果显示，在低于吡虫啉2.5 mg/kg、啶虫脒2.0 mg/kg 浓度农药处理组中蚯蚓存活情况良好，从而确定试验农药浓度为吡虫啉2.0 mg/kg、啶虫脒1.5 mg/kg。

称取200 g 过2 mm 筛的风干土样至500 mL烧杯中，分别将相应浓度的吡虫啉（2.0 mg/kg）、啶虫脒（1.5 mg/kg）充分混匀至土样中，每个烧杯中加入10 条大小、长度和体重相似的蚯蚓，放于避光处培养。共设置5 组：自然土壤（CK），土壤中添加吡虫啉（BCK），土壤中添加啶虫脒（DCK），土壤中添加吡虫啉与蚯蚓（B），土壤中添加啶虫脒与蚯蚓（D）。每处理设置3 个重复。培养条件为：持续黑暗，温度控制在25 ℃，每天对蚯蚓进行生物学观察，定期向土壤中加入无菌超纯水，控制含水量在30%左右。待试验结束（第28 天），将蚯蚓取出后，采土样保存于–80 ℃冰箱，备用。

1.2.2 土壤养分含量测定 土壤理化性质测定参照《土壤农化分析》[22]。pH 采用电极法测定，全氮（TN）采用凯氏定氮法测定，全磷（TP）采用钼锑显色法测定，全钾（TK）采用原子吸收分光光度法测定，土壤有机质（SOM）采用重铬酸钾容量法测定。

1.2.3 16S rRNA 高通量测序 根据E.Z.N.A.®soil DNA kit（Omega Bio-tek， Norcross， GA， U.S.）说明书进行土壤总DNA 抽提，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取质量，使用NanoDrop2000测定DNA浓度和纯度；使用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对16S rRNA 基因V3-V4可变区进行PCR 扩增，每个样本设置3 个重复。将同一样本的PCR 产物混合后使用2%琼脂糖凝胶回收PCR 产物，利用AxyPrep DNA Gel ExtractionKit（Axygen Biosciences， Union City， CA，USA）进行回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，并用Quantus™ Fluorometer（Promega， USA）对回收产物进行检测定量，利用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平台进行测序，委托上海美吉生物医药科技有限公司完成測序，通过比对Sliva 数据库（版本138）分析不同样品的细菌群落结构组成。

1.3 数据处理

采用JMP Pro14.3.0、Origin 2019b 软件进行数据处理和分析，采用Qiime 1.9.1、美吉生物云平台、Gephi 0.9、RStudio 等软件完成生物信息学分析。

2 结果与分析

2.1 样品中所含OTUs 数目分析

对5 个处理，共15 个样品进行高通量测序，按照97% 的相似水平对有效序列进行OTU（operational taxonomic unit， OTU）聚类，共获得3501 个OTUs。对各组样品的独有OTUs 和组间样品的重叠OTUs 进行Venn 图分析（图1）。自然土壤（CK）、土壤中添加吡虫啉（BCK）、土壤中添加啶虫脒（DCK）、土壤中添加吡虫啉与蚯蚓（B）、土壤中添加啶虫脒与蚯蚓（D）5 个处理的OTUs 总数分别为2598、1766、1903、2199 和2021，自然土壤的OTUs 数量最多，吡虫啉农药處理土壤的OTUs 数量最少；各处理组中特有的OTUs按数量高低排序为：CK>B>D>DCK>BCK，特有的OTUs 数目分别是247、135、80、45、27（表1）。

2.2 不同处理下土壤细菌α 多样性的变化

α 多样性可以确定微生物群落中物种丰富度及多样性的变化。通过分别计算α 多样性指数中Chao1 和Shannon 指数，对微生物群落中物种的丰富度和多样性进行分析。土壤细菌α 多样性的统计结果显示（表2），Chao1 和Shannon 指数在CK 与BCK、DCK 处理间存在显著差异（P<0.05），在所有处理中CK 的Chao1 和Shannon 指数最高；分别添加IMI、ACE 的BCK 和DCK 处理的Chao1和Shannon 指数最低；在引入蚯蚓之后的B 和D处理中，Chao1 和Shannon 指数有所提升。结果表明，自然土壤中的细菌群落物种丰富度和多样性最高；IMI、ACE 暴露降低了土壤细菌群落的丰富度和多样性，而添加蚯蚓提升了土壤细菌群落的丰富度和多样性，说明蚯蚓在IMI、ACE 污染土壤中的生长活动能够在一定程度上稳定土壤细菌群落结构。

2.3 不同处理对门、属水平下土壤细菌群落结构的影响

不同处理下土壤细菌群落物种门水平的相对丰度变化如图2 所示。将相对丰度大于1%的细菌门视为优势细菌门，从图2 中可以看出，在BCK和DCK 处理中， NEOs 对放线菌门（Actinobacteriota）、厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota）的相对丰度有显著影响。与CK 相比，BCK 和DCK处理的放线菌门（ 相对丰度分别为21.5% 和29.5%）、变形菌门（7.7%和10.1%）、拟杆菌门（1.6%和1.8%）、髌骨细菌门（Patescibacteria）（1.5%和1.8%），菌群丰度显著下降；加入农药前后，细菌优势菌门由CK 的放线菌门（39.5%）转变为BCK 和DCK 处理的厚壁菌门（55.8%和41.2%）；BCK 和DCK 处理的丰度变化基本相似。B、D 处理与BCK、DCK 处理相比较发现，加入蚯蚓显著提高了放线菌门、变形菌门、绿弯菌门和拟杆菌门的丰度，厚壁菌门的丰度则有所下降。

属水平上，对相对丰度大于2%的菌属变化进行分析（图3）。与CK 相比，BCK 和DCK 处理组中的芽孢杆菌属（Bacillus sp.）丰度明显增加，弱酸杆菌属（Ilumatobacter sp.）、甲基醌菌属（Demequina sp.）、微杆菌属（Microbacteriumsp.）、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）等菌属丰度减少；假芽孢杆菌属（Fictibacillus sp.）只存在于农药处理组；在加入蚯蚓的B 和D 处理中，芽孢杆菌属的丰度显著降低，而弱酸杆菌属、假单胞菌属和微杆菌属的丰度均有所提升。结果表明，IMI、ACE 暴露显著改变了土壤原有细菌群落结构组成，而蚯蚓的引入，在一定程度上恢复了IMI、ACE 暴露土壤的细菌群落结构。

为进一步了解细菌群落之间的相互关系，将所有处理后的细菌丰度前30 的菌属进行了相关性网络分析（R≥0.6， P<0.05）（图4）。结果表明，由于正相关的边数量（421）大于负相关的边数量（46），可以推断细菌菌群的协作关系大于竞争关系；从图中可以看出，大多数菌属属于放线菌门和变形菌门，放线菌门的链霉菌属、厚壁菌门中的芽孢杆菌属与各菌属之间的负相关关系较为明显。

2.4 土壤细菌群落结构变化与土壤理化性质的关系

不同处理28 d 后的土壤理化性质如表3 所示。与CK 相比，BCK 和DCK 处理的SOM、TN含量显著降低，TK 含量变化不明显，TP 和pH的变化不显著。添加蚯蚓后，与BCK 和DCK 处理相比，B 和D 处理中的TN、TK、TP 和pH 均有提高，SOM 含量显著降低。将所有土壤细菌分类属水平总丰度前30（R≥0.6， P<0.05）与5 个土壤环境因子之间的共现模式可视化为一个关联网络图（图5）。由图5 可以看出，占比最多的菌门是放线菌门（ Actinobacteriota ）； 髌骨细菌门（Patescibacteria）与环境因子呈正相关；放线菌门、绿弯菌门（ Chloroflexi ） 和变形菌门（Proteobacteria）的大部分菌属与环境因子呈正相关；厚壁菌门（Firmicutes）中的多数菌属均与环境因子呈负相关。放线菌门中的大部分菌属与环境因子呈正相关，小部分菌属与环境因子呈负相关，如，微杆菌属（Microbaterium sp.）与TN、TP、pH 呈正相关；微酸菌属（Ilumatobacter sp.）与TN、TP、TK、pH 呈正相关；类诺卡氏菌属（Nocardioides sp.）与pH 呈正相关；链霉菌属（Streptomyces sp.）与SOM 呈正相关，与TK、pH 呈负相关；马杜拉放线菌属（Actinomadura sp.）与SOM、pH 呈正相关，与TK 呈负相关。绿弯菌门（Chloroflexi）的大部分菌属与TK 等环境因子呈正相关；变形菌门（Proteobacteria）在与环境因子相关的3 个菌属中，2 个菌属与TN、TP、TK、pH 等环境因子均呈较强正向关联，1 个菌属与TN、pH 呈正相关，2 个菌属与SOM 呈负相关。在厚壁菌门（Firmicutes）中，多数菌属与TK 呈负相关，与SOM 呈正相关，如，芽孢杆菌属（Bacillus sp.）与TN、TP、TK、pH 等环境因子均呈负相关，且关联性较强，赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus sp.）与TP、TK 呈负相关，与SOM呈正相关。

在各处理的属水平上进行冗余分析（图6）。RDA 的2 个轴累积解释了68.49%的总变量，第1个轴和第2 个轴分别解释了65.64%和2.85%的变异度。其中，pH、TN、TK 和SOM 的箭头连线较长，TN 和pH 与第一轴的夹角比较小，SOM 相对于TP 和TK 夹角和线长都有优势。说明在属水平上，土壤pH、TN、TK 和SOM 能较好地解释土壤细菌群落结构差异性。

3 讨论

3.1 蚯蚓处理对吡虫啉、啶虫脒污染土壤细菌群落结构的影响

土壤微生物是生态系统中主要的分解者，土壤微生物种群结构是评价土壤质量的重要指标，较高的微生物多样性对于维持健康的农业生态系统至关重要[24]。

本研究在预试验蚯蚓生存情况良好的基础上，确定了土壤中吡虫啉（IMI）、啶虫脒（ACE）的浓度；试验中，为减少其他因素的干扰，每天观察记录红壤中蚯蚓的存活情况，及时将死亡蚯蚓挑出（用牙签刺激蚯蚓尾部查看有无反应判断蚯蚓是否死亡），因此，可基本排除蚯蚓死亡带来的试验干扰因素。高通量测序结果表明，加入IMI、ACE 显著降低了土壤细菌群落的物种丰富度和多样性；而添加蚯蚓，一定程度上稳定了受IMI、ACE 污染土壤的微生物群落结构。对门水平细菌群落结构进行分析发现，与CK 相比，BCK和DCK 处理的放线菌门、变形菌门、拟杆菌门和髌骨细菌门的丰度均降低，优势菌门由CK 的放线菌门转变为BCK、DCK 处理的厚壁菌门。厚壁菌门细菌均为革兰氏阳性菌，细胞壁中的肽聚糖结构使其具有较强的抗冲击能力[25]；在BCK 和DCK 处理中，厚壁菌门作为优势菌门，可能是由于IMI、ACE 的加入，对土壤微生物造成毒害，导致土壤中不耐受IMI、ACE 的细菌失活死亡，促使厚壁菌门细菌逐渐成为优势菌并大量繁殖，以此应对土壤中的污染。添加蚯蚓后，B、D 处理土壤中的厚壁菌门的丰度明显下降，变形菌门、放线菌门、拟杆菌门和髌骨菌门的丰度有所提升。

变形菌门是富营养菌，在营养充足的情况下丰度会增加[26]，其外膜可抵抗外界环境的侵害，使细菌具有较好的环境适应能力[27]；其丰度增加，可能是由于蚯蚓的添加，在土壤中挖孔取食增加了土壤养分和微生物活性，提升了微生物数量；放线菌门丰度有所提升，可能是蚯蚓在土壤中生长的过程中，其排泄物产生的放线菌含量较高导致的[28]。放线菌门、变形菌门、拟杆菌门是土壤中具有杀虫剂耐药性和大分子有机物的主要降解者，这些降解和耐受菌门丰度的提升，可能加速了土壤中新烟碱类杀虫剂的生物降解，减轻了其对土壤中微生物的毒害作用[29]。BCK 和DCK 处理中高丰度的厚壁菌门，暗示在其处理中可能存在有机污染物未被降解；B、D 处理中，蚯蚓引入后厚壁菌门的丰度明显下降，推测在蚯蚓的生长活动过程中，土壤中部分有机污染物可能被降解。由此可得，与CK 相比，NEOs 的加入改变了土壤细菌群落结构，且对大部分细菌有毒副作用，导致细菌丰度下降；与未添加蚯蚓的处理相比，加入蚯蚓的处理细菌群落结构发生了显著变化，土壤优势菌门组成也发生了改变，一定程度上恢复了土壤细菌群落结构。

3.2 蚯蚓与吡虫啉、啶虫脒污染土壤理化性质之间的关系

与CK 相比，随着IMI、ACE 的添加，BCK和DCK 处理的SOM 和TN 降低。这可能是由于IMI、ACE 的添加致使土壤微生物遭受胁迫，改变了微生物群落结构。厚壁菌门菌群具有较强的代谢活性，能够耐受大分子有机物的胁迫；作为BCK 和DCK 处理中的优势菌门，增加了部分重要氮循环过程所需微生物的丰度，导致土壤中的养分减少，这种变化与ZHANG 等[30]的研究结果一致。加入蚯蚓的B、D 处理的土壤pH 升高，说明蚯蚓的活动中和了土壤pH。土壤pH 作为影响土壤微生物多样性的重要因子，土壤酸化会导致农作物产量和质量降低，也会对生态环境产生负面影响，是土壤退化的重要表现。本研究在IMI、ACE 污染土壤中添加蚯蚓，蚯蚓可能在生活、取食、挖孔过程中，肠道及体腔分泌物质呈中性，生成了大量含碳酸钙或含氮类的碱性排泄物，从而提高了IMI、ACE 污染土壤的pH，对土壤酸碱进行了调节[31]。添加蚯蚓提高了土壤TN、TP、TK，这可能是由于蚯蚓吸食污染物后，其作穴、排泄等行为还可促进微生物活性、提高有益微生物数量，从而增加了土壤中的有效养分，改變了土壤养分的转化情况[18]。与CK 相比，加入蚯蚓后土壤SOM 含量降低，其原因可能是：一方面，蚯蚓钻孔掘穴可以增加孔隙度，加速土壤中有机物的分解；另一方面，蚯蚓在吞食土壤的过程中，加速了土壤SOM 的分解转化[32]。

土壤环境因子对微生物的生长活动有着重要影响，土壤理化性质不同，微生物群落组成也不同[33]。在本研究中，添加NEOs 后，SOM 和TN含量降低，说明施用NEOs 在一定程度上影响了土壤理化性质，改变了土壤细菌的群落结构；而加入蚯蚓在一定程度上提高了土壤肥力，恢复了污染土壤的细菌群落结构。

4 结论

吡虫啉、啶虫脒的暴露使土壤中原有微生物种群的丰富度和多样性降低，改变了细菌群落的结构组成；吡虫啉、啶虫脒的加入导致土壤中的有机质和全氮养分含量下降；蚯蚓的引入提高了受吡虫啉、啶虫脒污染土壤的pH 和土壤肥力，改善了吡虫啉、啶虫脒污染土壤中的细菌群落结构，提高了土壤中具有杀虫剂耐药性和降解杀虫剂能力的放线菌门、变形菌门、拟杆菌门等的丰度，研究结果为从蚯触圈中筛选出高效吡虫啉、啶虫脒降解菌提供了可行性。